張 曄 楊 斌 王毅軍 高英堂 白 同 白 彧 杜 智

肝細(xì)胞癌發(fā)生的分子機(jī)制仍不明確，但抑癌基因啟動子區(qū)的異常甲基化可使抑癌基因失活，是參與肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。肝癌相關(guān)的抑癌基因異常甲基化，具有腫瘤特異性，可能用于開發(fā)肝癌診斷及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。目前，對肝癌外周血游離DNA甲基化的研究局限于少數(shù)基因，結(jié)果也不盡相同［1-10］。本研究在肝癌血漿游離DNA中檢測了12個抑癌基因的甲基化狀態(tài)，首次篩查了肝癌特異性血漿游離DNA甲基化譜并評價其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集55例肝癌及54例慢性肝病（慢性病毒性肝炎或肝炎后肝硬化）患者全血標(biāo)本，所有患者均為天津市第三中心醫(yī)院2001年至2009年間住院患者。肝癌者經(jīng)手術(shù)治療，病理學(xué)檢查證實為肝細(xì)胞癌。慢性肝病者依據(jù)臨床表現(xiàn)及血清學(xué)、影像學(xué)、肝穿活檢等檢查做出臨床診斷。標(biāo)本取材通過倫理委員會審核，患者家屬知情同意。

1.1.2 臨床病理資料采集 55例肝癌患者中，男性46例，女性9例，中位年齡52.0歲，依據(jù)Child-Pugh標(biāo)準(zhǔn)評估肝功能，以影像學(xué)及術(shù)中所見評估腫瘤大體特征，結(jié)合影像學(xué)及病理所見評估血管侵犯，根據(jù)臨床及病理結(jié)果進(jìn)行國際TNM6分期。全部病例從手術(shù)日進(jìn)入隨訪，隨訪內(nèi)容包括術(shù)后復(fù)發(fā)時間、生存時間等。54例慢性肝病患者，男性42例，女性12例，中位年齡為50.2歲，包括慢性病毒性肝炎24例，肝炎后肝硬化30例。

1.2 方法

1.2.1 血漿游離DNA的提取 抗凝全血標(biāo)本經(jīng)3 000 g離心5 min，吸取上層血漿。400 μL血漿經(jīng)QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國Qiagen公司）試劑盒提取游離DNA，按操作說明進(jìn)行，DNA溶解于超純水中。

1.2.2 DNA的甲基化檢測 采用亞硫酸氫鈉修飾及甲基化特異性PCR（MSP）方法檢測12個目標(biāo)基因的甲基化狀態(tài)，目標(biāo)基因為 APC、p16、GSTP1、Cyclin D2、LHX1、TFPI2、DKK2、DKK3、SFRP2、14-3-3 sigma、ppENK、NPTX2。參考文獻(xiàn)方法對DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾及MSP檢測［11］。簡述如下，在上步提取的DNA標(biāo)本中加入3 M的NaOH、10 mM的對苯二酚和3 M的亞硫酸氫鈉溶液，溫浴，使DNA中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，完成修飾過程。用無水乙醇洗滌、沉淀修飾后的DNA，溶于TE緩沖液中作為MSP的模板。針對修飾后的DNA序列，設(shè)計各基因特異性的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各基因甲基化引物序列及退火溫度見表1。全部引物由上海超生生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件設(shè)定，預(yù)變性95℃，2 min；變性95℃，30 s，退火 35 s，延伸72℃，30 s；后延伸 72℃，5 min。每次PCR反應(yīng)均以超純水做陰性對照，以SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的外周血單個核細(xì)胞DNA作為各基因甲基化陽性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。如果某基因的甲基化引物可以擴(kuò)增出陽性結(jié)果，提示該標(biāo)本該基因呈甲基化狀態(tài)。用甲基化頻率（甲基化頻率=甲基化陽性例數(shù)/檢測標(biāo)本數(shù)×100%）表示各基因在不同組中的甲基化陽性率。用甲基化指數(shù)（methylation index，MI）反應(yīng)同一個標(biāo)本多個基因同時甲基化的狀態(tài)，MI定義為：MI=被檢測基因中發(fā)生甲基化的數(shù)量/被檢測的基因總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 13.0軟件完成，應(yīng)用Chi-square檢驗或Fisher確切檢驗比較肝癌組與慢性肝病組甲基化頻率差異。應(yīng)用t檢驗、Chi-square檢驗和Fisher確切檢驗分析肝癌中各基因甲基化狀態(tài)與臨床病理資料間關(guān)系，應(yīng)用Kaplan-Meier法建立肝癌中基因甲基化狀態(tài)的總體生存和無瘤生存曲線，以Log-rank方法進(jìn)行生存期假設(shè)檢驗。P＜0.05為假設(shè)檢驗具有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 MSP反應(yīng)各基因甲基化引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequences for PCR

表1 MSP反應(yīng)各基因甲基化引物序列及退火溫度 （續(xù)表1）Table 1 Primer sequences for PCR （Continued table 1）

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者臨床病理資料及隨訪結(jié)果

肝癌患者臨床病理資料顯示：年齡＞52歲的為27例，≤52歲的為28例，肝功能Child-Pugh A級為44例，Child-Pugh B級為11例，國際TNM6分期Ⅰ期為24例，Ⅱ期為31例。收集肝癌患者預(yù)后資料，55例患者隨訪期限1～43個月，中位隨訪時間為20個月，30例患者在隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)時間1～25個月，中位復(fù)發(fā)時間7個月。

2.2 MSP結(jié)果

MSP方法檢測12個抑癌基因的甲基化狀態(tài)，代表性電泳結(jié)果見圖1，各基因在不同組中的甲基化頻率如表2所示。比較不同組間各基因的甲基化頻率差別，其中，肝癌組中APC、Cyclin D2、TFPI2、DKK3和GSTP1基因甲基化頻率高于慢性肝病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 肝癌組和慢性肝病組多基因甲基化數(shù)量分析

在檢測的12個基因中，有5個基因在肝癌組甲基化頻率顯著高于慢性肝病組，選擇APC、Cyclin D2、TFPI2、DKK3和GSTP1 5個基因組成甲基化譜，計算每一例標(biāo)本的MI，肝癌組的MI中位值（0.6，IQR 0.4～0.8）明顯高于慢性肝病組MI中位值（0.2，IQR 0～0.2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.4 肝癌組多基因甲基化狀態(tài)與臨床病理和生存資料的相關(guān)分析

在分析5個肝癌甲基化特異性基因與臨床病理資料的相關(guān)性中，肝癌組病人分為高甲基化組（MI≥0.6）和低甲基化組（MI＜0.6）。結(jié)果顯示MI與患者年齡相關(guān)，年齡大的患者M(jìn)I值偏高（P=0.007），其它臨床病理參數(shù)與MI間未顯示顯著相關(guān)性。對甲基化狀態(tài)不同的肝癌患者的整體生存期和無瘤生存期進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，MI與腫瘤患者生存期未見明顯相關(guān)（表3，圖2，圖3）。

圖1 MSP甲基化引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Representative results of MSP

表3 肝癌組MI與患者整體生存和無瘤生存期相關(guān)性分析Table 3 Relation of MI with survival time in HCC

圖2 肝癌組患者無瘤生存曲線Figure 2 Disease-free survival curve of HCC patients

圖3 肝癌組患者總體生存曲線Figure 3 Overall survival curves of HCC patients

3 討論

目前，已有研究證實腫瘤患者外周血中游離DNA的含量高于正常人［12］，腫瘤患者游離DNA進(jìn)入血循環(huán)的可能機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死后DNA釋放進(jìn)入血循環(huán)，或者腫瘤細(xì)胞將DNA分子片段直接分泌到細(xì)胞外，進(jìn)入血循環(huán)［13］。檢測這些腫瘤特異性的DNA，有助于開發(fā)核酸類腫瘤標(biāo)志物。

關(guān)于肝癌外周血游離DNA的甲基化研究，目前已檢測的基因有RASSF1A［1-5］、p16［3-4，6-7］、p15［3，7-8］、APC［4-5，7］、FHIT［7］、E-cadherin［4，7］、GSTP1［4-5，9］、Cyclin D2［10］、SFRP1［5］等，各研究組檢測的基因不同，所用方法也不完全相同，對于相同的基因，結(jié)論也不完全相同。例如，Wong等［8］和Zhang等［3］的研究顯示p16基因在肝癌者游離DNA的甲基化率明顯高于肝硬化者，而Chang等［4］的研究卻顯示兩者間無差別。這種差異體現(xiàn)了因地域差異、受檢人群不同、樣本量偏小等因素造成的單基因檢測的不足。肝癌的發(fā)生、進(jìn)展涉及到許多抑癌基因的異常甲基化，多基因聯(lián)合檢測，合理組成甲基化譜，作為診斷或預(yù)后標(biāo)志物，其準(zhǔn)確性優(yōu)于單基因指標(biāo)。

本研究選擇的12個抑癌基因中，APC、Cyclin D2、TFPI2、DKK3、GSTP1的甲基化頻率在肝癌組中明顯高于慢性肝病組，具有較好的腫瘤特異性，可以作為甲基化譜的候選基因。Wang等［9］檢測32例肝癌患者外周血游離DNA的GSTP1甲基化，陽性率為50%，Tsutsui等［10］檢測70例肝癌者血清樣本，Cyclin D2甲基化陽性率為55.7%，Sun等［14］最近檢測游離DNA的TFPI2甲基化，顯示肝癌組甲基化率為46.5%，顯著高于對照組，Huang等［5］檢測游離DNA的APC甲基化，肝癌組顯著高于對照組。本研究GSTP1、Cyclin D2、TFPI2、APC甲基化陽性率分別為49.09%、63.64%、58.18%和78.18%，肝癌組顯著高于肝病組，結(jié)果及結(jié)論與上述研究相似，提示這4個基因具有較廣泛的代表性和肝癌特異性。此前，游離DNA中DKK3的甲基化檢測尚無報道，但在組織標(biāo)本中，該基因甲基化表現(xiàn)為肝癌的高發(fā)事件，且具有較好的特異性［15］。功能研究顯示這些特異的基因參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控等重要過程。如APC基因高甲基化失活后，可以激活Wnt/β-catenin途徑，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致肝癌形成［16］。DKK3是Wnt途徑的拮抗劑，甲基化使之失活，同樣可激活Wnt途徑，促進(jìn)腫瘤形成［17］。肝癌外周血游離DNA同樣具有這些特征，可從中檢測出特異的基因甲基化，是將這些特異基因作為生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)。

以APC、Cyclin D2、TFPI2、DKK3、GSTP1 組成肝癌特異的甲基化譜，以MI反應(yīng)甲基化譜整體的甲基化程度，肝癌組的MI顯著高于慢性肝病組，這反映了由慢性肝病到肝癌甲基化程度加強(qiáng)的過程。在慢性肝病組也同樣檢測到一些基因的甲基化事件，這種甲基化異常被認(rèn)為與年齡、營養(yǎng)等因素相關(guān)，甲基化譜可最大程度地減小單基因甲基化受背景因素的干擾。對臨床病理資料與MI進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MI與年齡相關(guān)，年齡高者，MI值較大，這與Ahuja等［18］的研究結(jié)論一致，該研究以組織標(biāo)本為材料，顯示出年齡是導(dǎo)致基因高甲基化的重要因素，本研究在游離DNA標(biāo)本中，同樣顯示出隨著年齡增長，甲基化程度增強(qiáng)的趨勢。在生存分析中，MI與無瘤生存期和整體生存期均未見相關(guān)性，提示以目前的5個特異基因組成的甲基化譜，尚不能作為肝癌預(yù)后評估的指標(biāo)。擴(kuò)大甲基化譜的基因數(shù)量，加入與肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲力等密切相關(guān)的抑癌基因，可能會發(fā)現(xiàn)生存期與基因甲基化程度間的聯(lián)系，進(jìn)而篩選出較好的預(yù)后指標(biāo)。

今后，增加候選基因、擴(kuò)大樣本量、進(jìn)行前瞻性研究將更好地優(yōu)化、驗證甲基化譜作為腫瘤標(biāo)志物的價值。

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