李進(jìn)，李祥，陳建偉，王盛，陳瀚 （南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046）

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，性苦、寒，主要功效是清熱解毒，涼血利咽［1］，在臨床上常用于病毒性疾病及細(xì)菌感染性疾病的治療，尤其在抗病毒方面療效確切［2］。微波提取法是我國(guó)中藥制藥現(xiàn)代化推廣技術(shù)之一，現(xiàn)在已廣泛的用于中藥有效成分的提取中，具有效率高、選擇性好、節(jié)能省時(shí)、污染小的優(yōu)點(diǎn)［3－5］。中國(guó)藥典2010年版一部中板藍(lán)根的質(zhì)量控制指標(biāo)是表告依春，所以考察微波提取法優(yōu)選板藍(lán)根生物堿部位的工藝，利用新技術(shù)研究傳統(tǒng)中藥，對(duì)中藥的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)都很有意義。

1 材料

板藍(lán)根藥材購(gòu)自安徽中原銅陵中藥飲片有限公司（批號(hào)110115），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)的干燥根；表告依春對(duì)照品（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，批號(hào)10122601，純度≥99.0%）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司）。

Sartorius BT125D型電子天平（SHIMADUZU）；HWC3－LA型微波提取設(shè)備（廣州興興微波能設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1200）。

2 方法與結(jié)果

2.1 表告依春的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 C18反相色譜柱（Hypersil C18，4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇－水（10∶90），流速：1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm，柱溫：30℃。在該色譜條件下，色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1結(jié)果表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 表告依春對(duì)照品（A）與樣品（B）高效液相圖Fig 1 The HPLC chromatograms of control solution（A）and sample solution（B）

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密稱(chēng)取表告依春對(duì)照品1.2 mg，置于10mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，作為表告依春的對(duì)照品溶液（0.12mg·mL－1）。精密吸取對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10mL于10mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，各進(jìn)樣10μL，依“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定表告依春的峰面積。以表告依春的進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X，μg），峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得到回歸方程：Y＝6 368 X＋130.78（R2＝0.999 9），說(shuō)明表告依春進(jìn)樣量在0.48～2.4μg范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 板藍(lán)根藥材按一定條件進(jìn)行微波提取，所得藥液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、減壓干燥得板藍(lán)根浸膏；精密稱(chēng)定提取浸膏適量，置于5mL量瓶中，加適量水定容至刻度。超聲處理30min，放冷、搖勻后，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度 取表告依春對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣5μL按“2.1.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定表告依春對(duì)照品溶液色譜峰面積，RSD為0.67%。

2.1.5 穩(wěn)定性 精密吸取同一份供試品溶液，在0，4，8，12，16，24h分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定表告依春峰面積，RSD為0.44%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性 取同一份提取浸膏樣品0.04g，精密稱(chēng)定，依“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，平行操作6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣5μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算表告依春的含量。RSD為0.58%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 取已知含量（表告依春6.25μg·g－1）的板藍(lán)根微波提取干浸膏0.04g，精密稱(chēng)定，置于2mL量瓶中，平行6份，加入表告依春對(duì)照品溶液1mL（0.12mg·mL－1），振搖混勻，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，由回歸方程計(jì)算其回收率，結(jié)果表告依春的平均加樣回收率為97.25%，RSD為1.91%。

2.2 總生物堿的含量測(cè)定 微波提取液調(diào)堿性（pH 8～9），取20mL經(jīng)201×7型陰離子交換樹(shù)脂柱處理（樹(shù)脂量5mL，流速1.0mL·min－1），流出液置25mL量瓶中，以純化水定容刻度。然后精密移取定容后的藥液適量，以返滴定法滴定（酚酞為指示劑），計(jì)算總生物堿含量［6］。

2.3 微波法提取板藍(lán)根生物堿部位及表告依春的正交試驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 微波提取過(guò)程中主要的影響因素是輻射功率（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、浸泡時(shí)間（D）等［5］，依據(jù)文獻(xiàn)查閱和預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)如表1所示的因素水平表，對(duì)微波提取板藍(lán)根生物堿及表告依春的工藝進(jìn)行優(yōu)選。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取過(guò)2號(hào)篩的板藍(lán)根藥材粗粉100g，以水為提取溶劑按表1中的條件提取，提取液離心、取續(xù)濾液。測(cè)定續(xù)濾液中總生物堿和表告依春的含量，結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，見(jiàn)表3、表4。

表1 試驗(yàn)因素與水平表Tab 1 The factors and levels in the extraction of alkaloids from Isatidis Radix

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，針對(duì)總生物堿指標(biāo)，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小順序?yàn)锳＞D＞C＞B，最佳的工藝為A2B2C2D3，A因素對(duì)結(jié)果的影響最大，A、D兩因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異；針對(duì)表告依春指標(biāo)，各因素對(duì)結(jié)果的影響順序?yàn)镈＞B＞A＞C，最佳的工藝條件為A3B2C3D2，D因素對(duì)結(jié)果影響最大且差異顯著。考慮到生產(chǎn)中低耗、高效、有效成分損失小等因素，結(jié)合以上分析結(jié)果，選擇最佳工藝條件為A3B2C2D2，即板藍(lán)根藥材過(guò)2號(hào)篩粉末，料液比30倍，浸泡25min，輻射功率600W，提取8 min，提取2次。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 總生物堿含量方差分析Tab 3 Analysis of variance of the content of total alkaloids

表4 表告依春含量方差分析Tab 4 Analysis of variance of the content of epigoitrin

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取過(guò)2號(hào)篩的板藍(lán)根粉末100g，以?xún)?yōu)選得到的工藝條件提取，平行3份，測(cè)得板藍(lán)根中總生物堿及表告依春的含量分別是10.68%、2.41mg·g－1，RSD＜3%，符合要求。證明該工藝穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of verification experiment

2.3.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 取過(guò)2號(hào)篩的板藍(lán)根藥材粗粉100g，第1次8倍量水回流提取1h，第2次6倍量水回流提取1.5h，合并提取液，離心，取續(xù)濾液［7］。測(cè)定續(xù)濾液中總生物堿和表告依春的含量。結(jié)果如表6所示。由表可以看出2種方法得到的浸膏固體量相差不多，但是有效成分的含量相差明顯，主要是因?yàn)榛亓魈崛〉玫降亩嗍且恍┐蠓肿尤缍嗵?、蛋白質(zhì)類(lèi)成分，所以微波提取法效果更好。

表6 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Results of comparison experiment

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明，用微波法提取板藍(lán)根生物堿活性部位省時(shí)、高效、節(jié)能，提高了藥材有效成分的利用率，對(duì)于現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)有積極的推動(dòng)意義。

此外，板藍(lán)根的臨床用藥是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果［8］，本實(shí)驗(yàn)以總生物堿和表告依春的含量為指標(biāo)，指標(biāo)過(guò)于單一。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，一方面要選擇更多的有效部位與單體結(jié)合作為指標(biāo)，來(lái)優(yōu)選微波法提取板藍(lán)根有效部位的工藝；另一方面，要把實(shí)驗(yàn)室得到的工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)，以使工藝更完善、更符合生產(chǎn)需求。

［1］中國(guó)藥典.一部［S］.2010：191.

［2］湯杰，施春陽(yáng)，徐晗，等.板藍(lán)根抑菌抗炎活性部位的評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（6）：327－328.

［3］張晶，陳全成，弓曉杰，等.不同提取方法對(duì)人參皂苷提取率的影響［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（1）：71－73.

［4］張麗，詹文紅，李作平.微波萃取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15（1）：21－23.

［5］謝黎崖，任寬，黃鑫.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選芒果苷的微波提取工藝［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（15）：1331－1333.

［6］劉春葉，于周龍，田凱，等.附子在炮制中主要生物堿含量變化的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（4）：960－962.

［7］王瑩瑩，李祥，陳建偉，等.板藍(lán)根水提部位化學(xué)成分研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（2）：54－56.

［8］何立巍，李祥，陳建偉，等.板藍(lán)根抗病毒有效部位篩選［J］.中國(guó)藥房，2008，19（33）：2565－2566.