王 玨，張 健，劉 濤

（1.湖北醫(yī)藥學院形態(tài)學實驗室，十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，十堰442000）

目前，隨著醫(yī)學技術的快速發(fā)展，人乳頭瘤樣病毒（human papillomavirus，HPV）6/11原位雜交檢測技術在醫(yī)學領域中已被逐漸推廣應用，因其有著特異性強、敏感度高且定性定位準確的特點，使其在科研教學和臨床外檢中被廣泛應用。此技術雖然簡單，但操作卻比較嚴格，否則會影響到檢測結果，影響病理診斷，筆者通過反復實驗觀察，總結針對易出現(xiàn)問題的環(huán)節(jié)提出以下注意事項，以供大家參考。

1 材料與方法

1.1材料 40例疑似HPV感染患者均來自于本院病理科；原位雜交HPV6/11試劑購于福建泰普公司。

1.2方法 所有標本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋。石蠟切片4μm厚，裱片于涂有γ-氨丙基三乙氧硅烷（3-Triethoxysilylpropylamine，APES）的防脫片載玻片上，常規(guī)脫蠟至水。

1.2.1組織消化 將切片放入雜交增強液中，微波高溫消化15 min×2次，自然冷卻后蒸餾水洗5 min×3次。

1.2.2組織雜交 ①滴加雜交液于組織上，蓋上蓋玻片，封口膠密封；②將切片放置于95℃的原位雜交儀中變性5 min后，再待溫度下降到37℃時，孵育4～16h（此步驟在原位雜交儀中自動完成）；③檸檬酸修飾的磷酸緩沖液（citric acidcontaining phosphate buffer solutions，CPB S）中浸泡脫片，溫度48～55℃，洗 5 min×3次。

1.2.3信號放大與顯色 ①加一抗，37℃孵育30 min后，PBS（37℃）洗 3 min×3次；②加二抗，室溫孵育20min后，PBS洗3min×3次；③加辣根過氧化酶（HRP）聚合物，室溫孵育30min后，PBS洗 3 min×3次；④二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下控制，蘇木素復染，1%的鹽酸乙醇分化，溫水返藍，中性樹膠封片。

2 結果

40例標本，陽性38例，陽性率達95%，病變部位主要分布在表皮淺層的挖空細胞，胞核呈黃褐色的顆粒狀，呈彌漫或散在分布，背景清晰，色差對比度強，見圖1。

圖1 HPV6/11原位雜交（DAB顯色×400）

3 討論

原位雜交是分子病理學領域里新開展的一項技術，其雜交原理是利用熒光、生物素、地高辛標記的探針，根據(jù)堿基配對的原理，與組織細胞中的核酸序列特異雜交結合，再經(jīng)信號放大后顯色來進行定性定位的，從組織固定到后期實驗操作，必須注重每個環(huán)節(jié)，每個步驟都可能影響實驗結果的客觀性，因此在操作時，應注意以下幾個方面。

組織和載玻片的處理：組織的固定最好用中性福爾馬林，其優(yōu)點在于除了能保持細胞的原始形態(tài)結構外，還能最大限度的保存細胞內(nèi)的脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的水平，使探針能最大限度地進入細胞內(nèi)且不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生交叉連接反應；載玻片經(jīng)清潔液浸泡24 h后，流水沖洗，再經(jīng)200℃高溫烤干，然后涂APES膠，自然風干后待用。這樣處理載玻片是因為原位雜交的每個步驟都離不開水環(huán)境，經(jīng)過處理后的載玻片，除了防止組織脫片外，還可以除去玻片表面的污漬，提高玻片透明度，便于光的折射，這些都是做好原位雜交的基礎。

消化和雜交：這些步驟主要與反應的時間、溫度和濃度等關系密切。消化的目的是提高組織的滲透性和探針的穿透力，便于探針和細胞內(nèi)的核酸雜交，增強其陽性信號，降低背景著色，為雜交創(chuàng)造條件。筆者的經(jīng)驗是經(jīng)微波高溫15 min×2次，注意中途添補液體，以防干片造成非特異性結合，出現(xiàn)假陽性；雜交的條件最好控制在95℃，變性5 min，然后在37℃環(huán)境中孵育4～16 h左右，在雜交儀中放入保濕物，以保證試劑不被蒸發(fā)干；消化和雜交的時間過長，或溫度和濃度過高都會破壞組織細胞的核酸的形態(tài)結構，但反之則會降低探針對細胞的穿透力，使雜交受阻，減弱低拷貝數(shù)病毒的檢出率。漂洗切片的PBS緩沖液的pH值應在7.4～7.6之間，溫度在48～55℃之間最佳，只有在此環(huán)境里操作，才能有效地降低背景著色，提高反差效果，這是實驗成敗的關鍵步驟。

信號放大與顯色：放大信號則是在雜交結合的基礎上，經(jīng)過一抗二抗和HRP聚合物的共同作用下逐步形成的，起著定位定性的關鍵作用，若作用時間和環(huán)境溫度過高，則易造成非特異性染色，可能造成假陽性；若時間和溫度過低，則會是陽性信號減弱，甚至消失；DAB顯色則是在了解其原理的基礎上，憑著豐富的實踐經(jīng)驗在顯微鏡下觀察控制，筆者的經(jīng)驗是在見到表皮淺層出現(xiàn)黃褐色顆粒狀就立即終止顯色，再經(jīng)流水沖洗，最后蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化片刻，切忌時間不宜過長，否則蘇木素會覆蓋黃褐色的陽性信號，造成主次顛倒的后果。

綜上所述，原位雜交技術操作的步驟是固定不變的，但每一個人的操作都可能存在差異，因此只有規(guī)范操作，并分析實驗結果成敗的原因，才能得到準確，客觀的實驗結果，從而給臨床病理診斷提供重要的參考依據(jù)。