楊鵬翔，徐銳鋒，趙 蕓，劉順英，胡文浩

（1.華東師范大學上海分子治療與新藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，上海 200062；2.中國計量科學研究院，北京 100013）

近年來，質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展及其在生物、無機和有機金屬化學領(lǐng)域的廣泛使用極大地推動了質(zhì)譜分析儀在氣相反應平衡研究中的應用［1－4］。在質(zhì)譜分析中，由 Cooks教授最先提出的動力學方法已被用于氣態(tài)熱動力化學的測定，包括氣相酸度、堿度、質(zhì)子親和力、電子親和勢、電離能、金屬離子的親合力，以及配位分子的空間異構(gòu)電場對陽離子的親合力、能量分配和手性分析上的作用［3－8］。該理論將離 子－分 子反應（I－M反應）和碰撞誘導解離（CID）技術(shù)相結(jié)合，用以表征中心離子配位數(shù)及中心離子和配體之間的絡合［9－12］。螯合配體和溶劑配體與過渡金屬離子的氣相I－M反應的平衡常數(shù)也已被用于確定配位鍵的強弱［13－17］。Vachet等研究了過渡金屬離子和配合物之間的I－M反應，發(fā)現(xiàn)配位數(shù)為3的絡合體系很容易與溶液試劑（包括水和甲醇）發(fā)生絡合反應［11］。

本研究利用質(zhì)譜分析儀的CID功能產(chǎn)生可控的外界能量使原有的過渡金屬配合物的配位鍵斷裂，同時利用質(zhì)譜分析過程中的I－M反應研究絡合體系的重新建立和平衡。通過對配位化合物［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋（配位數(shù)為4）在質(zhì)譜離子阱中的動力學行為分析發(fā)現(xiàn)：CID可以使甲醇和CoII之間的配位鍵斷裂，破壞初始的絡合平衡體系，致使絡合體系的配位數(shù)由4降為3。新形成配位數(shù)為3的絡合體系在CID的激發(fā)下，通過I－M反應捕獲配體H2O，形成新配位鍵，得到配位數(shù)為4的配位化合物［（Cys－H）CoII（H2O）］＋；之后，該配位化合物在CID的沖擊下失去配體H2O，隨即又捕獲MeOH分子回到初始的配位數(shù)為4的化合物［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋。以上過程簡而言之，穩(wěn)定的高配位數(shù)化合物在CID的沖擊下變成不穩(wěn)定的低配位數(shù)化合物，隨后通過I－M反應捕獲新的配體，返回能量更穩(wěn)定的高配位數(shù)化合物，重新達到平衡。這種配位平衡的打破和新平衡的自動建立包括配體損失、捕獲和交換等步驟。結(jié)合CID和I－M反應，可以利用離子阱質(zhì)譜儀研究在氣相中的配位化合物的形成，配位新平衡的建立，并比較配位化合物的穩(wěn)定性以及可控的配位平衡等。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo LCQ離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

所有化學品均為 Aldrich Chemical（St.Louis，MO，USA）公司產(chǎn)品，使用前并未進行純化處理；所有溶劑均為色譜純：Aldrich Chemical公司產(chǎn)品；純水由超純水系統(tǒng)制備（超純水系統(tǒng)為美國Millipore公司產(chǎn)品）。

1.2 配位化合物溶液的配制

在樣品準備時，半胱氨酸和氯化鈷溶解在V（甲醇）∶V（水）＝50∶50的混合溶液中，最終獲得氨基酸濃度為5×10－3mol／L，金屬鹽濃度為5×10－4mol／L。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子檢測模式（ESI＋），噴霧電壓4.5kV，毛細管電壓15V，毛細管加熱溫度150℃，鞘氣（N2）流量40units；使用直接進樣的方法以10μL／min的流速進樣；所有涉及CID實驗離子選擇隔離寬度為m／z4，激活Q值為0.25；所有質(zhì)譜是50個連續(xù)掃描的平均。

2 結(jié)果與討論

2.1 配位數(shù)與儀器參數(shù)設置的關(guān)系

配位化合物的形成以及它們之間的相對比例與ESI源的參數(shù)設置有關(guān)。含5×10－3mol／L半胱氨酸和5×10－4mol／L氯化鈷的V（甲醇）∶V（水）＝50∶50的混合溶液以10μL／min的流速進入離子阱質(zhì)譜儀ESI源，其質(zhì)譜圖示于圖 1a。其 中，m／z211 為 鈷 配 位 化 合 物［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，m／z122為半胱氨酸離子［Cys＋H］＋，m／z140為半胱氨酸水合離子［Cys＋H2O＋H］＋。當毛細管的溫度從150℃降至100℃后，在ESI源中有更多的鈷離子配位化合物生成，同時還有配位數(shù)更高的鈷離子配位化合物生成，如［（Cys－H）CoII（MeOH）（H2O）］＋及［（Cys－H）CoII（MeOH）2］＋，示于圖1b。該實驗表明，電噴霧電離源（ESI）可以用來產(chǎn)生氣態(tài)過渡金屬離子配合物，并可以通過改變儀器參數(shù)在一定程度上控制配位數(shù)的高低。

圖1 含有5×10－3 mol／L半胱氨酸和5×10－4 mol／L氯化鈷的V（甲醇）∶V（水）＝50∶50混合溶液的ESI＋質(zhì)譜圖Fig.1 ESI mass spectrum of V（methanol）∶V（water）＝50∶50 solution containing CoCl2（5×10－4 mol／L）and cysteine（5×10－3 mol／L）in positive mode

2.2 不同配位化合物在CID源作用下的相互轉(zhuǎn)化

離子阱質(zhì)譜分析儀的CID可以打斷配位化合物的配位鍵。m／z211的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋在離子阱CID的作用下，中心離子CoII與配體MeOH的配位鍵被打斷，失去一分子的 MeOH后成為m／z179［（Cys－H）CoII］＋；隨后捕獲H2O生成新的m／z197的配位化合物［（Cys－H）CoII（H2O）］＋，示于圖2a。m／z179的［（Cys－H）CoII］＋在CID的作用下可以捕獲配體MeOH和H2O，變成高配位數(shù)的配位化合物［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋，示 于 圖 2b。［（Cys－ H）CoII（H2O）］＋在離子阱中同樣會在CID的作用下遵循“失去配體，同時捕獲新配體”這一規(guī)律，分別生成 ［（Cys－ H）CoII］＋和 ［（Cys－ H）CoII（MeOH）］＋，示于圖2c。

3個配位化合物 ［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋和［（Cys－H）CoII］＋的相互轉(zhuǎn)化可以在MS2～MS6連續(xù)CID過程中觀察到，示于圖3。由于每次CID都會有部分離子損失，離子數(shù)量在MS6后太少，已無法檢測?？梢酝茰y，如果沒有離子損失，在CID的激發(fā)下這種配位化合物之間的轉(zhuǎn)化將不斷進行。

這3個配位化合物之所以能夠相互轉(zhuǎn)化，究其原因是由配位化合物的結(jié)構(gòu)及離子阱中的氣態(tài)環(huán)境決定的。對于配位化合物［（Cys－H）CoII］＋，半胱氨酸和鈷離子之間有3個配位鍵［11－12，18－19］，配位數(shù)為3，該結(jié)構(gòu)是一種不飽和的配位結(jié)構(gòu)，而配位數(shù)為4的鈷離子配位化合物更加穩(wěn)定［20］，示于圖4。［（Cys－H）CoII］＋傾向于捕獲另外一個配體達到更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，如圖4中的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋。MeOH和H2O作為樣品的溶劑和樣品一起通過ESI氣化變成氣態(tài)分子，持續(xù)地進入離子阱質(zhì)譜儀。因此，離子阱中持續(xù)地存在著MeOH和H2O分子，它們作為配體參與了鈷離子配位化合物地形成和轉(zhuǎn)化。

圖2 30ms CID激發(fā)下的MS／MS質(zhì)譜圖Fig.2 MS／MS spectrum of the cysteine－bound cobalt（II）complex under CID with 30ms collision time

圖3 3個半胱氨酸鈷（Ⅱ）配合物在多級CID（MS2～MS6）激發(fā)下的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系圖Fig.3 The scheme of the transformation among the cysteine－bound cobalt（II）complexes in the course of MSn（n＝2to 6）

2.3 CID激發(fā)時間與3個配位化合物在離子阱中相對豐度之間的關(guān)系

在使用CID技術(shù)打斷配位鍵時，可以通過控制CID的激發(fā)時間來控制I－M的反應時間。在［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的CID實驗中，當CID剛開始作用時，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋立即失去 MeOH 產(chǎn)生大量的［（Cys－H）CoII］＋，示于圖5。隨著CID激發(fā)時間的增加，［（Cys－H）CoII］＋的數(shù)量逐漸減少，同時［（Cys－H）CoII（H2O）］＋出現(xiàn)并逐漸增多。這說明［（Cys－H）CoII］＋捕獲了離子阱中的 H2O分子，生成［（Cys－H）CoII（H2O）］＋［11］。隨著 CID激發(fā)時間的增加，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋減少的速度越來越慢，200ms后出現(xiàn)反彈。說明［（Cys－H）CoII］＋捕獲了離子阱中的 MeOH 分子，從而回到了［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的結(jié)構(gòu)。同時，200ms后［（Cys－H）CoII（H2O）］＋也減緩了增長速度，700ms后轉(zhuǎn)向下降。這說明在生成［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋之間有一定的競爭。在CID激發(fā)時間1 500ms時，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋依然在下降，而［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋依然在上升。

由于LCQ的離子阱最長只能激發(fā)1 500ms的CID，因此無法知道最終平衡時，3個配位化合物在離子阱的相對豐度。而［（Cys－H）CoII（H2O）］＋的CID實驗可以提供線索，比較這3個配位化合物的穩(wěn)定性。在該實驗中，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋在 CID 的激發(fā)下立即失去H2O生成［（Cys－H）CoII］＋，生成的［（Cys－H）CoII］＋會捕捉離子阱中的H2O和 MeOH，變成更穩(wěn)定的高配位數(shù)離子［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋，示于圖6。在CID的800ms激發(fā)時間后，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的量已經(jīng)超過［（Cys－H）CoII（H2O）］＋，并且在1 500ms的 CID 激發(fā)時，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的增加依然是直線上升，而且［（Cys－H）CoII（H2O）］＋和［（Cys－H）CoII］＋仍是持續(xù)減少。這意味著在LCQ離子阱中更傾向于生成［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，這一結(jié)論也可以在［（Cys－H）CoII］＋的CID試驗中得到驗證。

圖4 半胱氨酸鈷（Ⅱ）配合化合物的結(jié)構(gòu)Fig.4 The structures of the cysteine－bound cobalt（II）complexes

圖5 在不同的CID激發(fā)時間下，配位化合物離子［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和其失去配體 MeOH后的［（Cys－H）CoII］＋及再次捕獲配體H2O后生成的［（Cys－H）CoII（H2O）］＋ 三者之間豐度的變化Fig.5 Under the varied CID collision time to the target complex［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋ ，he fraction of ion abundance from ［（Cys－H）CoII］＋ ，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋ ，and［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋

圖6 在不同的CID激發(fā)時間下，配位化合物離子［（Cys－H）CoII（H2O）］＋和其失去配體 H2O后的［（Cys－H）CoII］＋及再次捕獲配體MeOH后生成的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋三者之間豐度的變化Fig.6 Under the varied CID collision time to the target complex［（Cys－H）CoII（H2O）］＋ ，the fraction of ion abundance from［（Cys－H）CoII］＋，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋and［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋

在離子阱中對［（Cys－H）CoII］＋施加CID時，［（Cys－H）CoII］＋并沒有解離為更小的離子，反而從一起進入離子阱的溶劑分子中捕獲一個配體，生成配位數(shù)為4的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋，示于圖7。雖然最初［（Cys－H）CoII（H2O）］＋多于［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，但在 CID 為1 100 ms的激發(fā)時間后，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的量超過［（Cys－H）CoII（H2O）］＋并持續(xù)直線增加。因為LCQ質(zhì)譜分析儀是用渦輪泵（turbo pump）抽走氣態(tài)分子的，而渦輪泵的效率與分子質(zhì)量成反比，所以離子阱中H2O的量遠大于MeOH。因此，在［（Cys－H）CoII］＋受到外來能量激發(fā)的初始階段，其與配體H2O反應生成［（Cys－H）CoII（H2O）］＋的反應速率較大，這一階段，以H2O為配體的化合物為主要產(chǎn)物。與H2O相比，MeOH是更強的路易斯堿 （lewis basic），更容易提供電子對給不飽和配位化合物［11］，即［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的穩(wěn)定性高于［（Cys－H）CoII（H2O）］＋。因此，隨著反應地進行，越來越多的［（Cys－H）CoII］＋捕獲配體MeOH生成更加穩(wěn)定的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋。

圖7 在不同的CID激發(fā)時間下，配位化合物離子［（Cys－H）CoII］＋及其捕獲配體MeOH／H2O后的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋三者之間豐度的變化Fig.7 Under the varied CID collision time to the target complex［（Cys－H）CoII］＋ ，the fraction of ion abundance from［（Cys－H）CoII］＋ ，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋and［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋

比較圖5，6和7，當CID的激活時間超過200ms，3個配位化合物的熱力學曲線非常吻合，［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋都保持著線形的持續(xù)增長，同時［（Cys－H）CoII（H2O）］＋和［（Cys－H）CoII］＋幾乎平行的遞減。

3 結(jié)論

在［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋和［（Cys－H）CoII］＋的 CID 試驗中，研究了這3個配位化合物的相互轉(zhuǎn)化過程。在CID的持續(xù)激發(fā)下，3個配位化合物離子會自發(fā)地按照鈷離子配位化合物的熱力學穩(wěn)定性增加或減少，同時，受到離子阱中MeOH和H2O的相對含量及它們路易斯堿性的強弱差異的影響，氣相系統(tǒng)最終達到 ［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋含量最多，［（Cys－H）CoII（H2O）］＋其次，［（Cys－H）CoII］＋最少的平衡狀態(tài)。

由此試驗可推斷，在［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的 CID 中，［（Cys－ H）CoII（MeOH）］＋的數(shù)量會繼續(xù)增加直到恢復到CID激發(fā)前的平衡。這也與［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的熱力學穩(wěn)定性相一致：配位數(shù)為4的配位化合物［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋的內(nèi)能在CID的激發(fā)下提高，而變?yōu)椴环€(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過釋放配體MeOH減少內(nèi)能。但生成的［（Cys－H）CoII］＋具有不飽和配位鍵，從離子阱中捕獲MeOH和H2O，回到結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且能量更低的［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋，并生成少量的［（Cys－H）CoII（H2O）］＋。在［（Cys－H）CoII（MeOH）］＋和［（Cys－H）CoII（H2O）］＋之間的相互轉(zhuǎn)化反應中，［（Cys－H）CoII］＋起到了反應中間體的作用。

該實驗表明，可以利用質(zhì)譜分析儀的電噴霧（ESI）源產(chǎn)生氣態(tài)配位化合物，利用離子阱的多級CID技術(shù)提高配位化合物的內(nèi)能，從而破壞配位平衡，利用離子阱中I－M反應能力及其對離子的檢測能力來研究氣態(tài)中的金屬配位化合物和配位平衡。

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