冷維亮 畢欽祥 劉英昊 史 振 朱琳琳

（山東省濰坊市水文局 濰坊 261031）

1 引言

在水庫富營養(yǎng)化的研究中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的最常用指標(biāo)之一。葉綠素a的實(shí)驗(yàn)室測量方法有分光光度法、熒光法、色譜法，其中傳統(tǒng)的分光光度法因所需儀器價(jià)格較低、操作簡單、測定結(jié)果穩(wěn)定，因此應(yīng)用最為廣泛。2013年之前采用的標(biāo)準(zhǔn)方法存在耗時(shí)長、提取不完全、步驟繁瑣等缺點(diǎn)，根據(jù)一些文獻(xiàn)報(bào)道提出的對標(biāo)準(zhǔn)方法的優(yōu)化和改進(jìn)，水利部發(fā)布了新的測定標(biāo)準(zhǔn)以代替原先采用的測定標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)與老標(biāo)準(zhǔn)的不同之處主要包括以下四個(gè)方面：（1）改變了濾膜類型，用玻璃纖維濾膜代替了原標(biāo)準(zhǔn)中的醋酸纖維濾膜；（2）改變了水樣過濾時(shí)的操作，由原標(biāo)準(zhǔn)的抽干濾膜改為不抽干濾膜，而是在減壓狀態(tài)下緩慢結(jié)束抽濾，最后用濾紙吸干水分；（3）改變了細(xì)胞破碎方式，用反復(fù)凍融法代替了之前的研磨法；（4）改變了提取時(shí)間，由原標(biāo)準(zhǔn)的24h改為4～12h。新標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)發(fā)布近一年時(shí)間，目前尚無對新老標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)性比較評價(jià)。

本文選取以上新老標(biāo)準(zhǔn)中的4點(diǎn)不同，以濰坊峽山水庫的庫中水樣為實(shí)驗(yàn)對象，進(jìn)行葉綠素a的測定比較。從葉綠素a細(xì)胞破碎的程度、提取的完全性、數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和操作的簡便性等方面對兩種測定方法進(jìn)行比較，為水庫的富營養(yǎng)化浮游植物的生物量的快速、穩(wěn)定且準(zhǔn)確的表征標(biāo)準(zhǔn)的選擇提供資料。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料

峽山水庫庫中水20L，采集于深色塑料桶中，每升水樣加入1mL1%的碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起的色素溶解。

化學(xué)試劑：90%丙酮溶液、1%碳酸鎂懸濁液。

其他材料：醋酸纖維濾膜（0.45μm）、玻璃纖維濾膜（0.7μm）、研缽、布氏漏斗、抽濾瓶、具塞刻度離心管(10mL)、移液管等。

2.2 主要儀器與設(shè)備

真空泵、離心機(jī)、超低溫冰箱、UV-分光光度計(jì)等。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)由兩名分析人員同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)需要比較的內(nèi)容，分別根據(jù)新老標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行以下4個(gè)步驟。由于比較的側(cè)重點(diǎn)放在新標(biāo)準(zhǔn)上，所以除比較的步驟外，其他均按照新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，A組嚴(yán)格按照新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，作為參照組與其他組進(jìn)行比較。根據(jù)峽山水庫庫中水葉綠素a常規(guī)含量，均取1000mL水樣進(jìn)行測定，比色皿光程選用3cm。

2.3.1葉綠素a的抽濾

2.3.1.1濾膜的選擇

A組選取玻璃纖維濾膜（0.7μm），B組選取醋酸纖維濾膜（0.45μm）進(jìn)行抽濾。均在水樣剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。

2.3.1.2抽濾的操作

均選取玻璃纖維濾膜（0.7μm）進(jìn)行抽濾，A組逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。C組抽濾至過濾器內(nèi)無水分后，繼續(xù)抽濾幾分鐘。

2.3.2葉綠素a的提取

2.3.2.1細(xì)胞的破碎

均選取玻璃纖維濾膜（0.7μm）進(jìn)行抽濾，且按照以上2.3.1.2中A組的方法處理濾膜。A組將過濾后的濾膜放入具塞玻璃離心管中，蓋緊塞帽，放入-40℃低溫冰箱中冷凍20min，取出放置于室溫下5min，此過程反復(fù)3次。向離心管中加入10mL90%丙酮溶液，蓋緊塞帽劇烈搖振片刻。D組將載有濃縮樣品的濾膜放入研缽中，加入3mL丙酮溶液至濾紙浸濕的程度，把濾膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把濾膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液將已磨碎的濾膜和丙酮溶液洗入帶刻度的帶塞離心管中。

2.3.2.2葉綠素a的提取

均使用反復(fù)凍融法對細(xì)胞進(jìn)行破碎，A組放置于4℃冰箱中避光浸泡12h備用，在浸泡過程中再次搖振2～3次。E組置于4℃的冰箱中避光浸泡24h。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與比較

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對以上5組提取液測定吸光度，求算葉綠素a含量。檢測結(jié)果見表1，其中1、2為兩位分析人員的編號。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從對葉綠素a提取的效率即葉綠素a提取含量的均值看，濾膜類型的選擇和提取時(shí)間12h/24h對檢測結(jié)果基本沒有影響，抽濾方式和細(xì)胞破碎方式的不同對檢測結(jié)果的影響較為明顯。以下將結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行詳細(xì)分析。

3.2 濾膜選擇的影響

雖然對最終檢測的結(jié)果影響較小，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，選取醋酸纖維濾膜（0.45μm）的B組在測定吸光度時(shí)，750nm處的吸光度在0.007～0.010之間，不能滿足標(biāo)準(zhǔn)不超過0.005的要求。經(jīng)過取上清液再次離心、標(biāo)定，此過程反復(fù)2次，經(jīng)第3次離心之后吸光度才滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。造成這種情況的原因在于醋酸纖維濾膜能夠部分溶解于丙酮溶液中，對750nm處的吸光度造成一定的影響，而玻璃纖維濾膜是不溶于丙酮溶液的。所以，在條件允許的情況下，盡量選取玻璃纖維濾膜，否則應(yīng)多次離心或者離心后采用針式過濾器過濾，保證750nm吸光度不超過0.005。

表1 檢測結(jié)果比較

3.3 抽濾選擇的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，抽干的濾膜檢測結(jié)果要比用濾紙吸干偏小。造成這種情況的原因在于采用反復(fù)凍融法對細(xì)胞進(jìn)行破碎，是利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶脹來達(dá)到破碎細(xì)胞壁的目的，因此抽濾后的濾膜不宜過干。所以在凍融的過程中，由于濾膜水分含量較少，冰凍和溶解時(shí)間不宜過長，冰凍時(shí)間應(yīng)控制在20～30min，溶解時(shí)間為5min左右，濾膜變軟即可。

3.4 細(xì)胞破碎方式的影響

大量文獻(xiàn)表明，研磨法容易造成檢測結(jié)果偏低，這與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是吻合的。研磨過程中，細(xì)胞的破碎程度、洗脫的程度以及研磨時(shí)間的長短都會因操作人員的不同而有所變化，造成對提取效率、損失程度和光解程度的影響。并且由于研磨的程度不同，為避免濾膜殘片對測定吸光度的影響，需要經(jīng)過多次離心，本次實(shí)驗(yàn)為2次離心。而凍融法只要冰凍和溶解的溫度和時(shí)間一致，細(xì)胞的破碎程度不會受到人員不同的影響。并且，凍融法減少了分析人員接觸丙酮的時(shí)間，保護(hù)了分析人員的身體健康；且操作簡單，轉(zhuǎn)移次數(shù)少，降低了樣品的損失，避免了研磨中的人為誤差，提高了檢測的準(zhǔn)確度和精確度。

3.5 提取時(shí)間的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，提取時(shí)間12h和24h對檢測結(jié)果基本沒有影響。但從檢測的效率來看，12h剛好可以利用夜間時(shí)間，符合實(shí)際檢測工作的需要。

4 結(jié)論

以濰坊峽山水庫的庫中水為實(shí)驗(yàn)對象，經(jīng)試驗(yàn)比較：

（1）從實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和操作復(fù)雜程度來看，應(yīng)選用玻璃纖維濾膜。

（2）根據(jù)反復(fù)凍融法的需要，抽濾后的濾膜不宜過干，所以應(yīng)在水樣剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。

（3）無論是從方法的可靠性和穩(wěn)定性，還是從實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和操作復(fù)雜程度來看，反復(fù)凍融法都要優(yōu)于研磨法。

（4）提取時(shí)間12h/24h對檢測結(jié)果基本沒有影響。根據(jù)實(shí)際檢測工作的需要，提取時(shí)間12h較為合理。

綜合上述分析，相比之前的標(biāo)準(zhǔn)方法，新標(biāo)準(zhǔn)提取效率高、穩(wěn)定性好、耗時(shí)短、操作簡單，是一種合理實(shí)用的葉綠素a測量方法，尤其是應(yīng)急監(jiān)測或大批量水環(huán)境樣品測定時(shí)更顯優(yōu)勢■