陳 友 胡佳娟 陳勇敢

（1.瓊州學(xué)院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學(xué)，海南 三亞 572000）

海南尖峰嶺野生靈芝菌種培養(yǎng)基配方篩選*

陳 友1胡佳娟2陳勇敢1

（1.瓊州學(xué)院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學(xué)，海南 三亞 572000）

以瓊州學(xué)院靈芝栽培培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，對海南尖峰嶺兩種野生靈芝的一、二、三級菌種的培養(yǎng)基配方進行篩選試驗結(jié)果，一級種較優(yōu)培養(yǎng)基為PDA+1/4MS（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1/4MS培養(yǎng)液、20 mL的1/4MS培養(yǎng)基）；二級種的較優(yōu)培養(yǎng)基為Y1005（木屑78％、麥麩或米糠20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量50％～60％），三級種的較優(yōu)培養(yǎng)基為Y3102（木屑73％、黃豆粉5％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％～65％）。

海南；野生靈芝；培養(yǎng)基；配方；篩選

靈芝（Ganoderma lucidum）[1]素有“仙草”、“瑞草”之稱，古今藥理與臨床研究均證明其有防病治病、延年益壽的功效。

靈芝屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬[2]，主要生長在雨林、山坡草地和海濱紅樹林中腐朽的樹干、樹根或木樁上[3]。我國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣[2]，計有78種，分屬4屬、3亞屬、2個組[4]，以海南島分布種類最多，占全國靈芝科的53.6％[2]。

靈芝豐富的生物活性成分決定了其功能的多樣性[5]。目前已分離到靈芝的150余種活性成分，有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸、蛋白質(zhì)類、三萜類和礦質(zhì)元素[6]等。其中，靈芝多糖能提高機體免疫力、刺激干擾素的形成，同時能提高機體抗病毒、抗氧化、抗腫瘤[7]、耐缺氧等多方面的功能[8]，還能有效地促進肝臟、骨髓、血液中DNA 、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而達到益壽延年的功效[9]；靈芝中所含有的纖維素可在大腸中脫水，能有效地防止便秘，還可降低膽固醇，預(yù)防動脈粥樣硬化等；從靈芝粗脂肪中分離出的三萜類物質(zhì)，具有止痛、鎮(zhèn)靜、解毒、保肝、抑制組織胺釋放、毒殺腫瘤細胞等多種功效，而其藥理藥效對人體無任何副作用[10]。

野生靈芝品種的馴化研究是資源利用中不可或缺的一環(huán)。筆者選擇海南尖峰嶺不同原生境的兩種野生靈芝作為材料，以瓊州學(xué)院靈芝培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，優(yōu)化一級、二級、三級菌種的培養(yǎng)基配方，用以培育優(yōu)良菌種，供后期人工栽培。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料是兩株生長于海南省尖峰嶺地區(qū)不同原生境的野生靈芝。將黃邊靈芝（Ganoderma luteomarhinatum）編號4-3，咖啡網(wǎng)孢芝（Humphreya coffeatum)編號4-5。

1.2 試驗方法 培養(yǎng)基供試配方見表1。

（1）一級種（母種）培養(yǎng)。以配制100 mLPDA培養(yǎng)基為例說明。首先按配方稱量各種原料的1/10，加水適量，加熱后濾液，加水至100 mL。加瓊脂煮溶，補水至100 mL的濾液置于250 mL錐形瓶內(nèi)，于121 ℃下滅菌20 min。然后，將滅好菌的培養(yǎng)基分成9個平板，貼標(biāo)簽。其他3種培養(yǎng)基中1/2MS、1/4MS和1/10MS培養(yǎng)基是由標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基分別稀釋至2倍、4倍和10倍后加入。

表1 靈芝一、二、三級菌種的培養(yǎng)基試驗配方

過夜待平板內(nèi)水分被培養(yǎng)基完全吸收后，分別接入兩種靈芝菌種，每個菌種每種培養(yǎng)基接3個平板，并做好標(biāo)記。用保鮮膜將平板封緊，背面以所接菌種為原點，畫兩條相互垂直的線，記作A、B，每兩天記錄一次各平板A、B線上菌絲圈的直徑大小，累計7次，歷時14天。通過數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計分析，確定兩種靈芝各自最佳的生長配方。最后以最佳者為一級種接種到二級培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

（2）二級種的培養(yǎng)。根據(jù)配方配制所需培養(yǎng)基。以Y1004為例，首先按比例稱取各原料并攪拌均勻，邊攪拌邊加水，含水量約60％，以手用力抓料，指縫中無水滴出但松手后手掌濕潤為宜。培養(yǎng)料裝瓶（15瓶）后，貼上標(biāo)簽，將料瓶及其他用具于121 ℃下滅菌120 min后，及時轉(zhuǎn)移至接種室，待溫度降至室溫后進行接種并在標(biāo)簽紙上注明所接菌種的編號及接種日期。

將培養(yǎng)瓶置于25 ℃下培養(yǎng)并適時記錄菌絲的生長高度。滿瓶后，分別以時間、高度、長勢為依據(jù)計算、分析、比較各靈芝菌株在不同培養(yǎng)基上的生長速度，取最佳者作為二級種接種到三級培養(yǎng)基上。

（3）三級種的培養(yǎng)。三級種采用栽培袋培養(yǎng)，試驗步驟與二級種基本相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對靈芝一級種菌絲生長的影響由表2、圖1可知，靈芝4-3號的一級種菌絲在培養(yǎng)基PDA+1/4MS上的生長速度較快，長勢較好；而靈芝4-5號菌絲在培養(yǎng)基PDA+1/2MS和PDA+1/4MS上生長快，長勢好。綜合4-3號和4-5號的一級種生長情況，認為PDA+1/4MS培養(yǎng)基為一級種的較優(yōu)培養(yǎng)基配方。

2.2 不同培養(yǎng)基對靈芝二級種菌絲生長的影響由表2可知，靈芝4-3、4-5的二級種在培養(yǎng)基Y1005上菌絲生長速度快，密度大，為兩個菌種的二級種最佳培養(yǎng)基配方。所以，均以Y1005培養(yǎng)基上的菌落作為菌種接種到三級種培養(yǎng)基上。

2.3 不同培養(yǎng)基對靈芝三級種菌絲生長的影響由表2、圖2可知，靈芝4-3、4-5的三級種的菌絲均在培養(yǎng)基Y3102上生長速度快，且菌絲濃密，長勢良好；在培養(yǎng)基Y3101上菌絲前期長勢良好，但后期生長停滯并出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象。

表2 靈芝一、二、三級種在不同培養(yǎng)基上菌絲生長情況

3 討 論

圖1 不同培養(yǎng)基中靈芝一級種菌絲生長狀況

圖2 不同培養(yǎng)基中靈芝二級種菌絲生長情況

3.1 試驗中較適母種培養(yǎng)基配方是以PDA培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，加入MS母液進行梯度篩選，結(jié)果靈芝4-3號、4-5號的一級種在培養(yǎng)基PDA+1/4MS上的生長速度及長勢均很好。此配方既適合栽培種也適合野生種，可作為一級種培育的首選配方。試驗中靈芝4-5號在培養(yǎng)基PDA+1/2MS上也具有較佳生長速度，這說明野生靈芝不同品種的一級種配方還存在進一步優(yōu)化的空間。

3.2 兩個野生靈芝菌株二級種在Y1005培養(yǎng)基上均具有較佳長勢。4種培養(yǎng)基配方均以木屑為主料，試驗結(jié)果差異主要在于輔料。所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，蔗糖作為組織培養(yǎng)的碳源則具有普遍性和廣泛性。兩個菌株在Y1005麥麩培養(yǎng)基中菌絲生長速度快、菌絲濃密，而在Y1004玉米粉培養(yǎng)基中菌絲長速較慢、長勢較差。分析原因是麥麩顆粒較松散，培養(yǎng)料內(nèi)氧氣量充足，較適宜菌絲生長；而玉米粉顆粒間空隙小，菌種培養(yǎng)過程放置時間長易吐黃水，不利于菌絲生長。Y1005、Y1006的差異還在于Ca2+的存在形式，試驗表明石膏中的Ca2+較過磷酸鈣更利于靈芝吸收，且更經(jīng)濟，更具有可取性。

3.3 研究表明，主料中添加麥麩等含氮量高的輔料會明顯提高靈芝產(chǎn)量，添加量為20％時產(chǎn)量較高[11]。兩個靈芝菌株三級種在Y3102黃豆粉培養(yǎng)基上較Y3101玉米粉培養(yǎng)基生長速度快，菌絲濃密，這主要與黃豆粉較松散，利于菌絲生長有關(guān)。

參考文獻

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[10] 劉存芳. 靈芝營養(yǎng)成分綜述[J]. 南江科技, 2008(5):20, 122-129.

農(nóng)業(yè)部熱帶種質(zhì)資源保護項目《香蕉種質(zhì)資源調(diào)查與收集》（12RZZY-47）；瓊州學(xué)院青年教師科研基金項目《海南野生香蕉馴化研究》（No.QY200917）；三亞市院校專項資金項目《海南野生靈芝馴化研究》（No.YD09041）。

陳友(1975-)，男，講師，主要從事香蕉種質(zhì)資源多樣性及遺傳關(guān)系研究，E-mail:342389998@qq.com。