馮慧琴，楊明俊，楊曉彤，楊慶堯

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.上海芝草生物技術(shù)有限公司，上海 200234）

不同部位靈芝及子實(shí)體提取物中總?cè)扑岷繙y(cè)定

馮慧琴1，楊明俊1，楊曉彤1，楊慶堯2*

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.上海芝草生物技術(shù)有限公司，上海 200234）

建立不同部位靈芝及子實(shí)體提取物中總?cè)扑岷繙y(cè)定方法.靈芝樣品用乙醇提取，依次經(jīng)氯仿、5%碳酸氫鈉萃取，酸化后再用氯仿萃取、濃縮至干，稱重，即得靈芝總?cè)扑崃?結(jié)果：靈芝子實(shí)體總?cè)扑釣椋?.58±0.25）mg／g，孢子粉為（3.48±0.03）mg／g，菌絲體僅為（1.75±0.09）mg／g；菌蓋總?cè)扑岷繛椋?2.62±0.22）mg／g，菌柄為（7.66±0.08）mg／g. 10批次靈芝子實(shí)體的總?cè)扑岷糠秶鸀?.34～16.39 mg／g.靈芝子實(shí)體提取物中的總?cè)扑岷恳源?水提取物的最高為（208.70±5.54）mg／g；堿水提取物的最低，僅為（123.07± 4.99）mg／g.HPLC初步分析子實(shí)體和孢子及子實(shí)體提取物間三萜酸成分大部分相同.本法適用于靈芝子實(shí)體及其提取物、靈芝孢子和菌絲體總?cè)扑岬暮繙y(cè)定，結(jié)果可靠，可為靈芝產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)提供依據(jù).

靈芝；總?cè)扑?；子?shí)體；孢子；菌絲體；提取物

靈芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.）Karst是我國(guó)著名的藥用真菌，其中三萜化合物是靈芝的主要活性成分，據(jù)報(bào)導(dǎo)從靈芝子實(shí)體、孢子及菌絲體中分離的三萜化合物已約160種［1-5］，它們具有抑制腫瘤、保護(hù)肝臟、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制膽固醇合成、抗菌、抗炎、抗病毒等廣泛的藥理活性［ 2，6-7］，因此三萜化合物的含量是靈芝產(chǎn)品品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo).用HPLC方法定量分析靈芝三萜酸成分，丁平［8］測(cè)定了靈芝不同部位中靈芝酸B的含量，馬林［9］測(cè)定靈芝中孢子酸A、赤芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C的含量，馬利金［10］分析紅芝中靈芝酸A～C 3種成分的含量.本實(shí)驗(yàn)參照Tsuyoshi Nishitoba［11］分離靈芝酸和赤芝酸方法，測(cè)定了不同部位靈芝及子實(shí)體提取物的總?cè)扑岷浚侨扑嶂心骋换驇讉€(gè)成分.

1 材料與方法

1.1材 料

靈芝子實(shí)體(GL-F）和孢子(GL-S）產(chǎn)自金寨；另10批靈芝子實(shí)體市購(gòu)；靈芝菌絲體：液體培養(yǎng)，本所提供；靈芝水提取物(GL-WW）；靈芝水醇提取物(GL-WA）；靈芝醇水提取物(GL-AW）；靈芝堿水提取物(GL-LW），本所提供；氯仿、碳酸氫鈉、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 靈芝總?cè)扑岬闹苽?/p>

取靈芝子實(shí)體粉末或孢子或菌絲體10g，或靈芝子實(shí)體提取物2g，精確稱重，加100 mL水超聲5min，加95%乙醇100 mL，30℃磁力攪拌30 min，過(guò)濾，獲醇提取液1；殘?jiān)?00 mL 50%乙醇，30℃磁力攪拌30 min，過(guò)濾，得醇提取液 2，合并醇提取液1、2并濃縮，濃縮液加50 mL氯仿萃取，重復(fù)3次，氯仿萃取液中加50ml5%NaHCO3萃取，重復(fù)3次，NaHCO3液用2mol／LHCl調(diào)pH至 3，在酸性溶液中加氯仿50 mL進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，酸性氯仿萃取液合并濃縮至干，放置干燥器內(nèi)24 h，即得靈芝總?cè)扑?，精確稱重，計(jì)算：靈芝總?cè)扑岷浚届`芝總?cè)苹嶂亓?mg）／樣品重量(g）.

1.3 靈芝總?cè)扑岬腍PLC條件

采用Bechman System Gold高效液相色譜系統(tǒng)，包括125液相泵和168 DAD檢測(cè)器.色譜柱：Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：2%乙酸∶乙腈＝2∶1；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；進(jìn)樣體積：20μL；柱溫：27℃.

2 結(jié) 果

2.1 靈芝不同部位的總?cè)扑岷勘容^

分別取靈芝子實(shí)體(GL-F）、孢子(GL-S）、液體培養(yǎng)菌絲體(GL-M）、子實(shí)體中的菌蓋(GL-P）和菌柄(GL-ST），粉碎后按1.2方法制備，計(jì)算靈芝總?cè)扑岷?結(jié)果顯示GL-F含總?cè)扑?8.58±0.25）mg／g，GL-S的總?cè)扑岷繛?3.48±0.03）mg／g，而GL-M的總?cè)扑岷孔钌伲瑑H有(1.75±0.09）mg／g(圖1）.經(jīng)t檢驗(yàn)，GL-F、GL-S、GLM三者兩兩比較差異達(dá)極顯著水平(p＜0.01）.GL-P總?cè)扑岷繛?12.62±0.22）mg／g，GL-ST的含量為(7.66± 0.08）mg／g(圖1），t檢驗(yàn)兩者差異極顯著(p＜0.01）.

表1 市售10批靈芝子實(shí)體總?cè)扑岷勘容^

2.2 市售靈芝子實(shí)體總?cè)扑岷勘容^

將市售10批靈芝子實(shí)體分別粉碎后按1.2方法制備，計(jì)算靈芝總?cè)扑岷?結(jié)果表明10批靈芝子實(shí)體中總?cè)扑岷孔罡哌_(dá)(16.39±0.58）mg／g，最低僅為(4.34±0.21）mg／g；有4批靈芝總?cè)扑岷扛哂?0 mg／g，3批次的含量卻低于5 mg／g，不同靈芝子實(shí)體的總?cè)扑岷坎町惔?表1）.

2.3 子實(shí)體提取物中靈芝總?cè)扑岷康谋容^

將各提取物按1.2方法制備，計(jì)算靈芝三萜酸含量.結(jié)果由高至低如下：GL-AW∶(208.70±5.54），GL-WA∶(184.46± 3.75）mg／g，GL-WW∶(134.42±5.85）mg／g，GL-CW∶(123.07 ±4.99）mg／g.t檢驗(yàn)，GL-AW和GL-WA兩者總?cè)扑岵町愶@著(p＜0.05）；而GL-WW和GL-CW總?cè)扑岷繜o(wú)統(tǒng)計(jì)差異(p＞0.05），但兩者分別與GL-WA或GLAW比較總?cè)扑岷烤町悩O顯著(p＜0.01）.

靈芝子實(shí)體提取物所含的靈芝總?cè)扑岷恳蛱崛》椒ú煌?，但總?cè)扑岷烤h(yuǎn)高于未經(jīng)提取的靈芝子實(shí)體(GL-F）中的含量，GL-F的總?cè)扑釣?12.62±0.22）mg／g，其提取物總?cè)扑岷縿t是它的9～16倍(圖2）.

2.4 靈芝總?cè)扑岬腍PLC的初步分析

HPLC圖譜峰顯示，靈芝子實(shí)體和孢子有23個(gè)共有峰，兩者所含的三萜酸74%的成分相同，而菌絲體的三萜酸的成分較前兩者差異大(表2、圖3）.以GL-F序號(hào)7峰的峰面積為參照，計(jì)算各峰的相對(duì)峰面積，從相對(duì)峰面積中可推斷子實(shí)體的總?cè)扑岷棵黠@高于孢子和菌絲體(表2）.

圖2 不同靈芝子實(shí)體提取物中總?cè)扑岷勘容^

圖3 靈芝子實(shí)體、孢子粉、菌絲體的HPLC圖譜

表2 靈芝子實(shí)體、孢子和菌絲體HPLC圖譜峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

HPLC圖譜分析結(jié)果表明4種子實(shí)體提取物間有25個(gè)共有峰(表3、圖4），它們的總?cè)扑岢煞窒嗤糠纸?0%；以GL-CW的序號(hào)8的峰面積為參照，計(jì)算各峰的相對(duì)峰面積，從中可認(rèn)定AW總?cè)扑岷孔罡?，CW最低(表3）.

3 討 論

靈芝不同部位其靈芝總?cè)扑岷坎煌?馬林等［9］檢測(cè)了靈芝子實(shí)體、孢子粉、發(fā)酵菌絲體中靈芝酸B及C、赤芝酸A和赤芝孢子酸A 4種三萜酸含量，結(jié)果子實(shí)體占最多，其次為孢子粉，菌絲體最少，只檢出靈芝酸B；丁平［8］測(cè)定的不同部位靈芝酸B含量順序?yàn)榫w表皮＞菌蓋子實(shí)體＞菌柄＞木栓層＞孢子粉，菌絲體未檢出；本實(shí)驗(yàn)不同部位靈芝中總?cè)扑岷颗c前述文獻(xiàn)有相似結(jié)果，菌蓋、子實(shí)體、菌柄、孢子粉、菌絲體的靈芝總?cè)扑岷恳来芜f減，且菌絲體的三萜酸成分比子實(shí)體和孢子的少很多.

實(shí)驗(yàn)中子實(shí)體提取物的總?cè)扑岷窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體，提取物中GL-AW和GL-WA的總?cè)扑岷棵黠@超過(guò)GL-WW和GL-CW，用乙醇做溶劑提取靈芝子實(shí)體，可大大提高靈芝產(chǎn)品中的總?cè)扑岷?，提升產(chǎn)品質(zhì)量.

按照1.4方法測(cè)定靈芝總?cè)扑岷浚?次重復(fù)實(shí)驗(yàn)RSD為4.38%，重現(xiàn)性好.本法適用于靈芝子

實(shí)體、孢子、菌絲體和子實(shí)體提取物的總?cè)扑岷繙y(cè)定，結(jié)果可靠，可為靈芝產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)提供依據(jù).

表3 靈芝子實(shí)體提取物HPLC圖譜峰的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖4 靈芝子實(shí)體提取物的HPLC圖譜

［1］ 陳若蕓，于德泉.靈芝三萜化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1990，25（12）：940-953.

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FENG Huiqin1，YANG Mingjun1，YANG Xiaotong1，YANG Qingyao2*

(1.College of Life and Environment Sciences Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2.Shanghai Zhi-herb Bio-tech.LTD，Shanghai 200234，China）

Determ ination of total triterpenoid acids in different part and extract of Ganoderma lucidum

Aim To develop amethod for determination of total triterpenoid acids in differentpartand extracts ofGanoderma lucidum.Method The samples ofGanoderma lucidum were extracted with ethanoland successively extracted with CHCl3and 5%NaHCO3，the NaHCO3layerwas acidified to pH 3 with 2mol／LHCl，the resulting precipitateswere dissolved in CHCl3and evaporated in vacuo then weighed.The total triterpenoid acidswere obtained.Result The total triterpenoid acids of Ganoderma lucidum fruitbody，spore and mycelium were(8.58±0.25）mg／g，(3.48±0.03）mg／g and(1.75±0.09）mg／g respectively.The total triterpenoid acids of pileus and stipe were(12.62±0.22）mg／g and(7.66±0.08）mg／g.The range of total triterpenoid acid content among 10 batches ofGanoderma lucidumfruitbody purchased from the market was between 4.34 to 16.39 mg／g.The highest content fro／8／8／88／m Ganoderma lucidum fruiting body with alcohol-water extracting was(208.70±5.54）mg／g and the lowest contentwith alkaline solution extracting was(123.07±4.99）mg／g.The composition of total triterpenoid acid from fruitbody，spores and extract of fruitbody analyzed by HPLCwere almost the same.Thismethod is reliable for determination of total triterpenoid acid in the fruiting body and its extracts，spore and mycelium from Ganoderma lucidum，which provides an indicator for the quality of Ganoderma lucidum product.

Ganoderma lucidum；total triterpenoid acids；fruitbody；spore；mycelia；extract of Ganoderma lucidum

Q949.329＋.7

A

1000-5137(2013）02-0192-05

（責(zé)任編輯：顧浩然）

2012-11-02

上海師范大學(xué)橫向基金項(xiàng)目(C-6105-09-DL0703）

馮慧琴(1965-），女，上海師范大學(xué)微生物與免疫學(xué)研究所副研究員；楊慶堯(1936-），男，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授.

*通信作者