宋亞娥，張紅梅，李建粵*

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.上海市閔行區(qū)第三中學(xué)，上海 200240）

水稻Os05g0442400基因啟動(dòng)子分析以及由Os05g0442400基因啟動(dòng)子引導(dǎo)GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)

宋亞娥1，張紅梅2，李建粵1*

（1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2.上海市閔行區(qū)第三中學(xué)，上海 200240）

采用Plant CARE和PLACE軟件分析預(yù)測(cè)水稻Os05g0442400基因啟動(dòng)子序列中可能存在的順式作用元件.結(jié)果顯示，在起始密碼子ATG上游1500bp區(qū)域內(nèi)，除了啟動(dòng)子基本的核心作用元件外，還存在一些與植物抵御非生物脅迫過(guò)程有關(guān)的作用元件、脫落酸應(yīng)答元件、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子作用元件、病原菌誘發(fā)因子作用元件，以及根特異性結(jié)合位點(diǎn).采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將Os05g0442400 promoter：：gus構(gòu)建導(dǎo)入“中花11”水稻.由不同組織部位GUS染液檢測(cè)表明：在水稻苗期，內(nèi)源Os05g0442400基因可能主要在根部表達(dá)；隨著水稻生殖期的延續(xù)，水稻內(nèi)源Os05g0442400基因在穎殼中的表達(dá)區(qū)域由上向下面積增大，并在抽穗后達(dá)到最大表達(dá)區(qū)域.這些結(jié)果可能與Os05g0442400基因啟動(dòng)子上分別存在根特異性結(jié)合位點(diǎn)和光誘導(dǎo)啟動(dòng)子作用元件具有一定的聯(lián)系.

水稻；Os05g0442400基因；啟動(dòng)子；順式作用元件；轉(zhuǎn)基因；GUS報(bào)告基因

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式.植物轉(zhuǎn)錄因子家族成員非常龐大，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)劃分，可分為許多典型的轉(zhuǎn)錄因子家族，如bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子［1］、AP2／EREBP轉(zhuǎn)錄因子［2］、MYC轉(zhuǎn)錄因子［3］、MYB轉(zhuǎn)錄因子［4］等.其中MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝的調(diào)節(jié)，以及植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程.

Baranowskij等從馬鈴薯cDNA表達(dá)文庫(kù)中克隆出一種新的MYB蛋白基因——MYBST 1，用CaMV 35S最小啟動(dòng)子融合MYBST1蛋白不同DNA結(jié)合域，引導(dǎo)GUS報(bào)告基因(gus）及MYBST1基因編碼序列構(gòu)建了幾種不同的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有MYBST1親和結(jié)合域的啟動(dòng)子能夠引導(dǎo)GUS在煙草中高效表達(dá)，證明了MYBST1蛋白是一種轉(zhuǎn)錄激活因子［5］.Rose等人在番茄中也發(fā)現(xiàn)了一種MYBST1型的蛋白——LeMYBI蛋白，同樣用CaMV 35S最小啟動(dòng)子引導(dǎo)GUS報(bào)告基因及LeMYBI基因編碼序列構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，證明LeMYBI蛋白也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子［6］.這種類(lèi)型的MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠激活最小啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄.目前在水稻中尚無(wú)此類(lèi)型MYB轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)報(bào)道，為此，本文作者研究了水稻中與Mybst1、LeMYBI具有高同源性的Os05g 0442400，分析了Os05g0442400基因啟動(dòng)子的順式作用元件，并用pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，研究該基因的表達(dá)特性.開(kāi)展本試驗(yàn)，一方面可以進(jìn)行Os05g0442400基因的器官組織定位，以便更好地研究這一新基因及其編碼的蛋白；另外一方面可為水稻基因工程研究中需要選擇特殊類(lèi)型的啟動(dòng)子奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 水稻受體材料和轉(zhuǎn)化載體

以粳型水稻品種“中花11”(Oryza sativaL.japonica cv.Zhanghua11）為供試水稻.本研究使用的pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus雙元載體T-DNA上，含有由CaMV 35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的潮霉素抗性基因hpt，以及由水稻Os05g0442400基因啟動(dòng)子引導(dǎo)的GUS報(bào)告基因gus(圖1）.該載體由復(fù)旦大學(xué)葛曉春副教授饋贈(zèng).

圖1 pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter載體T-DNA結(jié)構(gòu)圖

1.2 水稻Os05g 0442400基因啟動(dòng)子區(qū)域序列分析

采用Plant CARE(http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／htm l／）和PLACE軟件(http：／／www.dna.affrc.go.jp）對(duì)Os05g0442400基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析.

1.3 載體pCAMBIA1301－Os05g0442400 promoter－gus轉(zhuǎn)化水稻

將構(gòu)建好的載體pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中.主要按照李建粵等的方法［7］，以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)“中花11”水稻幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化.

1.4 轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)

以TPS法提取水稻葉片全基因組DNA為模板，根據(jù)Os05g0442400基因序列設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)orward primer：5＇-AGTGGGATTGTGCGTCAT-3＇和Reverse primer：5＇-CAGCGGGCAGGATAAGAT-3＇，以pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化的水稻“中花11”為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR檢測(cè).PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃45 s、52℃1min、72℃45 s、32個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min.預(yù)計(jì)pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因植株能夠擴(kuò)增出一個(gè)977bp的條帶.擴(kuò)增后取5μL產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析.

1.5 T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株不同時(shí)期部分組織器官的GUS活性組織化學(xué)分析

按Jefferson(1987）的方法［8］，用GUS染液對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株不同時(shí)期部分組織器官進(jìn)行GUS染色分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻Os05g0442400基因啟動(dòng)子區(qū)域序列分析

起始密碼子ATG上游1.5 kb序列預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，Os05g0442400基因啟動(dòng)子內(nèi)存在多種類(lèi)型的順式作用元件(圖2）.除基本的啟動(dòng)子核心作用元件TATA盒和CAAT盒外，還含有一些可能與植物抗逆有關(guān)的順式作用元件，如：1個(gè)MYB結(jié)合序列MBS(-1142～-1137）、1個(gè)HSE(-525～-516）、2個(gè)ARE(-424～- 419，-980～-975）、1個(gè)脫落酸應(yīng)答元件ABRE(-333～-323）；光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的作用元件，如：3個(gè)SP1(-129～- 124，-453～- 434，-1381～-1376）、1個(gè)Pc-CMA2c (-1474～-1466）、1個(gè)GA-motif(-396～-390）、1個(gè)CATT-motif(-1289～-1284）、1個(gè)Box -4(-733～-728）、1個(gè)Box-I(-1152～-1146）、1個(gè)ATCC-motif(-848～-841）；一些與病原菌誘發(fā)因子表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)的作用元件，如：3個(gè)GT-1結(jié)合序列(-669～- 664，-1053～- 1048，-1269～-1264）、1個(gè)ASF-1結(jié)合序列(-1411～-1407）、2個(gè)MYBST1元件(-482～- 478，-803～-799）；以及一個(gè)根特異性結(jié)合序列Root specific motif(-1056～-1052）.

圖2 水稻Os05g0442400基因啟動(dòng)序列及1.5kb內(nèi)可解的順式作用元件

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及分子檢測(cè)

經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后，共有20棵T0代植株從獨(dú)立愈傷組織再生出苗.采用PCR檢測(cè)顯示，所有轉(zhuǎn)基因植株和pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus質(zhì)粒都能擴(kuò)增出977bp大小的條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株則沒(méi)有相應(yīng)的條帶(圖3）.

圖3 部分轉(zhuǎn)化pCAMBIAI1301-Os05g0442400 promoter-gus載體T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

2.3 T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株不同時(shí)期部分組織器官的GUS活性組織化學(xué)分析

圖4 苗期GUS表達(dá)情況

剪取苗期T0代PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的部分植株葉片及根，用GUS染液進(jìn)行染色.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因植株的根部，GUS顯色特別明顯(圖4A）；在葉片表面沒(méi)有GUS著色，但在葉片切口處也有GUS顯色(圖4B）.

在水稻進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期時(shí)，選取劍葉節(jié)在倒二葉節(jié)下方8cm左右水稻的幼穗，及劍葉節(jié)在倒二葉節(jié)下方5cm左右的小花，進(jìn)行GUS染色.觀(guān)察染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小穗的枝梗上GUS都能夠顯色(圖5A）；在穎殼上，GUS顯色部位主要在穎殼的頂端，而且在不同生長(zhǎng)時(shí)期的穎殼都有GUS顯色現(xiàn)象，并且隨著水稻生長(zhǎng)時(shí)期的延續(xù)，穎殼頂端GUS顯色區(qū)域由頂端向下延伸(圖5B）.同時(shí)，還對(duì)揚(yáng)花時(shí)的小花進(jìn)行GUS染液染色，并在解剖鏡下觀(guān)察了該時(shí)期小花內(nèi)部GUS著色情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該時(shí)期小花內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有部分GUS著色，主要分布在漿片和柱頭上.

圖5 轉(zhuǎn)基因水稻小花GUS表達(dá)情況

以“中花11”非轉(zhuǎn)基因水稻種子以及轉(zhuǎn)化CaMV 35S：：gus構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因水稻種子為對(duì)照，對(duì)Os05g0442400promoter：：gus轉(zhuǎn)基因T0代植株上收獲的T1代成熟種子進(jìn)行GUS檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在組成型CaMV 35S啟動(dòng)子引導(dǎo)下，轉(zhuǎn)基因水稻種子中的GUS基因能夠全部表達(dá)，而由Os05g0442400啟動(dòng)子引導(dǎo)的GUS基因，在種子中表達(dá)量較低，只有在個(gè)別種子種皮邊緣或胚部略有GUS染色(圖6）.

圖6 成熟的種子縱切面GUS染色

3 討 論

MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答、生物和非生物脅迫過(guò)程中起著非常重要的作用［9］.脅迫功能基因的表達(dá)受啟動(dòng)子中順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.在脅迫條件下，轉(zhuǎn)錄因子與脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子的順式元件結(jié)合，特異地啟動(dòng)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而做出調(diào)節(jié)反應(yīng).

基因表達(dá)位點(diǎn)分析對(duì)于指導(dǎo)基因工程研究中啟動(dòng)子的選擇具有重要的參考價(jià)值.本研究發(fā)現(xiàn)，由Os05g0442400基因啟動(dòng)子引導(dǎo)GUS報(bào)告基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)基因植株的幼苗期，GUS著色在根部最為明顯.由此推測(cè)，水稻內(nèi)源的Os05g0442400基因在幼苗期也可能主要在根部表達(dá).由轉(zhuǎn)基因水稻生殖發(fā)育期小花GUS檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，水稻內(nèi)源Os05g0442400基因主要在穎殼尖部表達(dá)，而且隨著生殖時(shí)期的延續(xù)，水稻內(nèi)源Os05g0442400基因在穎殼中的表達(dá)區(qū)域由上向下面積增大，在抽穗后的穎殼中表達(dá)范圍最大.這些結(jié)果可能與Os05g0442400基因啟動(dòng)子上分別存在根特異性結(jié)合位點(diǎn)和光誘導(dǎo)啟動(dòng)子作用元件具有一定的聯(lián)系.

通過(guò)本研究證實(shí)，Os05g0442400基因的啟動(dòng)子不僅可以作為改良苗期根部性狀或抽穗后穎殼性狀基因工程研究中的候選啟動(dòng)子，引導(dǎo)外源基因在水稻苗期根部或抽穗后的穎殼中高效表達(dá).而且，從轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子GUS檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，在碾米加工去除種皮和胚后，精米中無(wú)GUS顯色，這對(duì)于不希望在稻米食用部位表達(dá)的水稻基因工程研究，Os05g0442400基因啟動(dòng)子也是一個(gè)值得選擇的啟動(dòng)子.

啟動(dòng)子中是否具有病原誘導(dǎo)型作用元件對(duì)于植物的抗病性表現(xiàn)是非常關(guān)鍵的.目前已有一些關(guān)于啟動(dòng)子病原誘導(dǎo)型作用元件應(yīng)用方面的報(bào)道.Lv等通過(guò)融合小麥Act1基因的啟動(dòng)子核心元件，以及馬鈴薯和小麥Gst1基因啟動(dòng)子區(qū)受病原菌調(diào)控的順式作用元件序列而人工構(gòu)建了具有稻瘟菌誘導(dǎo)活性的嵌合啟動(dòng)子［10］.在本研究中通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子各個(gè)元件的分析也發(fā)現(xiàn)，Os05g0442400基因啟動(dòng)子含有一些與病原菌誘發(fā)因子表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)的作用元件，如：GT-1結(jié)合序列、ASF-1結(jié)合序列、MYBST1元件等.這些作用元件是否能夠應(yīng)用于水稻抗病基因工程還有待于進(jìn)一步的研究.

Os05g0442400基因啟動(dòng)子還含有ABA響應(yīng)元件ABRE，以及干旱響應(yīng)元件MBS，我們推測(cè)，該基因可能還參與水稻對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng).在逆境脅迫環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出高效的抗逆性，而在正常環(huán)境中，抗逆性表達(dá)很弱或者不表達(dá).要求轉(zhuǎn)基因植物能表現(xiàn)出上述的性狀，就應(yīng)該選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［11］.如將擬南芥rd29A基因的啟動(dòng)子與GUS基因連接導(dǎo)入煙草，GUS活性組織染色等分析表明，GUS基因的表達(dá)受干旱等脅迫因素的誘導(dǎo).分析表明，Prd29A也包含干旱響應(yīng)因子ABA(ABRE）［12］.在rd29A基因受到ABA誘導(dǎo)時(shí)，ABRE獨(dú)立起作用［13］.關(guān)于Os05g0442400基因啟動(dòng)子的ABRE和MBS調(diào)控元件對(duì)該基因表達(dá)是否存在調(diào)控作用，也需要相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.

致謝：本研究使用的pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus表達(dá)載體由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葛曉春副教授饋贈(zèng)，特此致謝.

［1］ NANTEL A，QUATRANO R S.Characterization of three rice basic／leucine zipper factors，including two inhibitors of Em-BP-1DNA binding activity［J］.JBiol Chem， 1996，271（49）：31296-31305.

［2］ RIECHMANN JL，MEYEROWITZ E M.The AP2／EREBP family of plant transcription factors［J］.Biol Chem， 1998，379（6）：633-646.

［3］ ABE H，YAMAGUCHISHINOZAKIK，URAO T，et al.Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought-and absdfic acid-regulated gene expresfion［J］.Plant Cell， 1997，9（10）：1859-1868.

［4］ MARTIN C，PAZ-ARES J.MYB transcription factors in plants［J］.Trends Genet， 1997，13（2）：67-73.

［5］ NADJA B，CLAUSF，SALOME P，et al.A novel DNA binding protein with homology to Myb oncoproteins containing only one repeat can function as a transcriptional activator［J］.The EMBO Journal， 1994，13（22）：5383-5392.

［6］ ANNKATION R，IRISM，UDOW.The tomato I-box binding factor LeMYBI is amember of a novel class of Myb-like proteins［J］.The Plant Journal， 1999，20（6）：641-652.

［7］ 李建粵，呂英海，楊麗君，等.轉(zhuǎn)反義蠟質(zhì)基因‘湘晴’及其雜交稻米的直鏈淀粉含量研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)， 2008，28（6）：1082-1087.

［8］ JEFFERSON R A.，KAVANAGH T A，BEVAN MW.GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fu-sion marker in higher plants［J］.The EMBO Journal， 1987，6（13）：3901-3907.

［9］ 陳俊，王宗陽(yáng).植物MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2002，28（2）：81-88.

［10］ Lv H F，Ming X T，Qu L J，et al.Construction of chimeric inducible promoters by elictitors of rice fungal blast pathogen and their expression in tran sgenic rice［J］.Chinese Science Bulletin， 2000，45（3）：242-246.

［11］ 于翠梅，馬蓮菊，張寶石.特異型啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用［J］.生物工程學(xué)報(bào)， 2006，22（6）：882-890.

［12］ 趙恢武，陳楊堅(jiān)，胡鳶雷，等.干旱誘導(dǎo)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的海藻糖-6-磷酸合酶基因載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性［J］.植物學(xué)報(bào)， 2000，42（6）：616-619.

［13］ 李新玲，楊傳平，曲敏，等.Rd29A啟動(dòng)子的克隆及提高煙草抗逆性的研究［J］.分子植物育種， 2007，5（1）：37 -42.

Analysis of the rice Os05g0442400 gene promoter and expression of the GUS fusion gene under control of the rice Os05g0442400 gene promoter in transgenic rice

SONG Yae1，ZHANG Hongmei2，LIJianyue1*
(1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2.The ShanghaiMinhang District Third Middle School，Shanghai 200240，China）

The promoter sequence of the rice Os05g0442400 gene was analyzed using Plant CARE and PLACE programs.Except the basic promoter cis-acting elements，several cis-acting elements，including the elements that related to plant resistance to abiotic stress，light-inducible promoter elements，pathogen-induced factor elements and the root specificmotif，were recognized in a 1500bp promoter sequence upstream of the initial codon ATG.The Os05g0442400 promoter：：gus contructwas transferred into rice successfully by Agrobacterium tumefaciens-mediated.The GUS expression in different tissues was assayed using GUS staining.The results showed that endogenous Os05g0442400 genemaymainly expressed in roots.With the continuation of rice reproductive stage，the expression area of Os05g0442400 gene in rice glume increased from top to bottom，and after heading the expression area reached themaximum.These resultsmay have some contactwith the rootspecificmotifand light-inducible promoter elements of Os05g0442400 gene promoter.

rice；Os05g0442400 gene；promoter；cis-acting elements；transgenic；GUS reporter gene

Q 341

A

1000-5137(2013）02-0186-06

（責(zé)任編輯：顧浩然）

2013-01-07

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)項(xiàng)目(2009ZX08009-071B）

宋亞娥(1985-），女，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生；張紅梅(1979-），女，上海市閔行區(qū)第三中學(xué)中學(xué)二級(jí)教師.

*通信作者