石其德，朱驪安，姜俊云，董惠鈞

(1.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006;2.聊城大學醫(yī)學院，山東 聊城 252000)

奧利司他是一種強效和長效脂肪酶抑制劑，能抑制腸道內脂肪酶活性，減少攝入脂肪的消化和吸收。作為一種新型減肥藥，它不會影響中樞神經系統(tǒng)，毒副作用也比較小[1]。目前國內奧利司他原料藥有2種工業(yè)化生產方法，即半合成法和全化學合成法。半合成生產工藝[2-3]為經微生物發(fā)酵獲得奧利司他前體物利普司他汀，初步分離精制獲得利普司他汀粗品，催化氫化利普司他汀轉化為奧利司他，最后經有機溶劑結晶精制獲得奧利司他合格成品。本研究中以半合成法生產奧利司他為例，對生產工藝中的雜質種類和來源進行了分析，提出了對工藝雜質和降解產物有效控制的策略和方法。由于奧利司他屬于新藥，2010年版《中國藥典》尚未收錄，因此本研究對于奧利司他生產過程中的質量控制具有借鑒和指導意義。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型(紫外檢測器)高效液相色譜系統(tǒng)。奧利司他對照品為自制，純度大于99.6%;乙腈為色譜純，甲醇、庚烷、過氧乙酸、鹽酸和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm，2.5 μm);流動相:乙腈 -水(80∶20);紫外檢測波長:195 nm;流速:1.2 mL/min;進樣量:20 μL。

2.2 工藝雜質分析

原料藥的工藝雜質主要是指反應副產物、未反應的原料或中間體及溶劑等。特別是對發(fā)酵原料藥而言，其工藝雜質來源和種類更為復雜和多樣，對這類原料藥工藝雜質的控制一直是項具有挑戰(zhàn)性的工作。另外，原輔料引入的雜質和反應過程中接觸設備或容器引入的雜質也是工藝雜質的可能來源。

利普司他汀發(fā)酵引入的雜質:前體物利普司他汀發(fā)酵不可避免地會引入雜質，給下游奧利司他的純化帶來困難。這些雜質主要是毒三素鏈霉菌次級代謝產物，與利普司他汀的相對保留時間分別為 0.67，0.75，0.80，0.94，1.10，1.26，這些雜質的性質與利普司他汀很相似，在高效液相色譜圖上的保留時間也非常相近(見圖1)，單純利用層析或萃取方法很難去除。按照人用藥品注冊技術規(guī)范國際協(xié)調會(ICH)的質量要求，未知雜質應控制在0.1%以下，故應通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵調控來有目的地控制和降低這些雜質的含量。再就是微生物代謝產生的水溶性和脂溶性色素，對于脂溶性色素可通過層析結合結晶的方法去除，只要下游純化工藝合理有效，這些色素雜質不會對產品的最終質量產生影響。

圖1 毒三素鏈霉菌發(fā)酵液中利普司他汀和主要雜質色譜圖

氧化作用產生的雜質:奧利司他從分子式組成上看屬于酯類物質，在接觸空氣或氧化性物質條件下，容易發(fā)生氧化反應。本研究中用含20%體積的3%過氧乙酸甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質量濃度，置振蕩器中處理60 min，模擬加速氧化過程，20 μL進樣、分析。結果見圖2和表1。與標準品相比，多出5個雜質峰，與主峰的相對保留時間分別為 0.42，0.47，0.49，1.20，1.32，而且主峰面積明顯減少，表明奧利司他發(fā)生了顯著分解。其中前3個雜質峰先于奧利司他出現(xiàn)，后2個雜質在奧利司他之后出峰，因此在生產過程中除了縮短制備時間、防止接觸氧化物質和充填氮氣來防止氧化外，對于前3個雜質，利用結晶法能夠比較容易去除;而對于極性弱于奧利司他的后2個雜質，則需要結合結晶和層析的方法才能去除得比較徹底。

圖2 不同處理條件下奧利司他高效液相色譜圖

表1 不同處理方法處理后的奧利司他原料雜質分析(相對保留時間)

自然降解產生的雜質:用含有20%(V/V)水的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質量濃度，置振蕩器中處理48 h，取20 μL進樣，分析。結果見圖2和表1，表明在含水的醇溶液中，奧利司他會發(fā)生水解，特征性雜質峰的相對保留時間為0.82，其他雜質還有0.42，0.52，而在不含水的醇溶液中奧利司他不發(fā)生水解(數(shù)據未列)。故在奧利司他制備過程相對保留時間0.82的雜質會成為主要雜質，增加純化的難度。故應盡量減少含水溶劑的使用，即使使用也應減少對奧利司他的作用時間。對于相對保留時間為0.82的雜質去除，最有效的方法是硅膠層析或利用中等極性有機溶劑進行反溶劑層析結晶。

受熱分解產生的雜質:用純甲醇溶解奧利司他配制成1 g/L的質量濃度，放置在60℃水浴中處理24 h，取20 μL進樣、分析。由于在制備工藝中存在減壓濃縮等工序，奧利司他會受熱作用。結果見圖2和表1，顯示相對保留時間1.37的雜質明顯增大，另外相對保留時間為0.82的雜質也增大。因此要控制減壓濃度溫度不能過高，同時處理時間盡可能短，或使用高效的降膜濃縮設備以減少受熱時間。對于相對保留時間為1.37的雜質，通過非極性溶劑結晶方法能夠去除。

遇酸性物質產生的雜質:用含有20%2 mol/L鹽酸的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質量濃度，置振蕩器中處理60 min，取20 μL進樣，分析。在酸性環(huán)境中，奧利司他發(fā)生明顯分解，相對保留時間為0.82的雜質峰顯著增大，而奧利司他主峰后的2個雜質峰也發(fā)生酸解(圖2和表1)。故無論在制備過程還是成品保藏中，應杜絕接觸酸性物質。

遇堿性物質產生的雜質:用含有20%2 mol/L氫氧化鈉的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質量濃度，置振蕩器中處理60 min，取20 μL進樣，分析。與其他處理條件相比，堿性環(huán)境對奧利司他的破壞分解作用最強。圖2顯示奧利司他完全分解消失，在相對保留時間0.58處出現(xiàn)1個明顯的雜質峰。故奧利司他遇堿最不穩(wěn)定，應在各個制備和保藏環(huán)節(jié)避免接觸堿性物質。

包裝材料雜質分析:在奧利司他的生產過程中，由于會使用能溶解聚乙烯等塑性材料的有機溶劑，如庚烷、丙酮和石油醚等，因此在與物料直接接觸的生產設備或器皿、密封材料和包裝材料的選擇上，要優(yōu)先選擇不銹鋼或耐有機溶劑腐蝕的材料。已有文獻報道了因奧利司他包裝材料的質量問題而引入的雜質[4]，對于此類雜質的防范，只需嚴格避免使用或接觸塑性材料即可。本研究中選用不同的包裝材質在恒溫、干燥條件下保藏奧利司他30 d，取樣利用高效液相色譜法分析奧利司他原料藥中的雜質情況。結果(表2和圖3)表明，用聚乙烯、硅橡膠和乳橡膠等包裝材料，會在奧利司他原料藥中引入數(shù)量和種類不同的雜質，而采用聚丙烯或聚酰胺類包裝材料則不會引入雜質。

表2 不同包裝材料在奧利司他原料藥中引入雜質的高效液相色譜鑒別

圖3 不同包裝材料貯存奧利司他的高效液相色譜圖

3 討論

奧利司他是一種新型減肥藥，進口膠囊劑已在我國上市多年，但由于工藝復雜和質量不穩(wěn)定，國內仿制藥于2011年才獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準。奧利司他是經過微生物發(fā)酵和化學轉化獲得的，步驟多，工藝控制嚴格，且由于原研廠商生產的奧利司他原料藥的雜質控制水平達到0.1%以下，對國內的仿制者來說是非常大的挑戰(zhàn)。目前，國內領先的原料藥廠商海正藥業(yè)和聯(lián)邦制藥主要通過動態(tài)軸向壓縮柱技術制備單雜在0.1%以下的奧利司他原料藥[5-6]。本研究通過試驗確定了奧利司他從生產到包裝過程中可能引入雜質的種類和可能的途徑，為奧利司他質量控制標準的建立提供了科學依據。在此基礎上，采取源頭控制降低發(fā)酵工藝雜質、重視中間流程控制雜質變化及升級核心技術去除手性雜質等措施，不采用制備色譜技術實現(xiàn)大規(guī)模生產單雜在0.1%以下的高品質奧利司他原料藥。

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