孫國清， 張 銳， 王 遠， 任茂智， 孟志剛， 周 燾， 陳全家， 曲延英， 郭三堆*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，北京100081；

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗性純度對產(chǎn)量的影響

孫國清1，2， 張 銳1， 王 遠1， 任茂智1， 孟志剛1， 周 燾1， 陳全家2， 曲延英2， 郭三堆1*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，北京100081；

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052

外源殺蟲基因能否在轉(zhuǎn)基因棉花中高效、穩(wěn)定表達是影響轉(zhuǎn)基因棉花應(yīng)用前景的關(guān)鍵。本文從轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲蛋白表達水平出發(fā)，通過在轉(zhuǎn)基因棉花品種的種子中混雜非轉(zhuǎn)基因棉花品種的種子，研究不同品種純度的轉(zhuǎn)基因棉花殺蟲蛋白表達水平對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性影響。本研究選用2個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種GK12和SGK321，設(shè)置了8種混雜比例，通過分子檢測和室內(nèi)生測試驗表明，隨著抗蟲純度的下降，棉鈴蟲危害等級升高，幼蟲校正死亡率下降，品種抗蟲能力下降；從田間實驗結(jié)果來看，隨著抗蟲純度的下降，鈴數(shù)減少，空果枝數(shù)增多，最終致使產(chǎn)量大幅下降，從而出現(xiàn)所謂的“抗蟲棉不抗蟲”現(xiàn)象。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達到97%，才可以保證產(chǎn)量不至于損失太大。

抗蟲性；產(chǎn)量；種子純度；轉(zhuǎn)基因棉花

我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉推廣歷時十七年，為我國的農(nóng)業(yè)發(fā)展做出了巨大貢獻［1］。但是，隨著品種的推廣應(yīng)用，生產(chǎn)上應(yīng)用品種的混雜問題也越來越突出。品種混雜會造成品種的種性降低，質(zhì)量下降。由于目前市場上，很多品種（系）性狀還未穩(wěn)定，利用雜種F2代進行種植，某些位點可能還處于分離期，或是由于天然異交原因使一些品種在推廣過程中產(chǎn)生混雜，致使品種內(nèi)可能不同程度混有非轉(zhuǎn)基因棉花種子，對其抗蟲性和產(chǎn)量產(chǎn)生影響。

棉花屬于錦葵科棉屬，為常異花授粉作物，天然異交率達3%～20%，高的可達60%，以自花授粉為主，主要性狀上多處于同質(zhì)結(jié)合狀態(tài)，但由于天然異交率較高，遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，群體則多處于異質(zhì)結(jié)合狀態(tài)［2］。生產(chǎn)上使用的品種多為群體品種或雜交種。因此，棉花種子在使用過程中，容易由于天然異交的原因，從而導(dǎo)致品種純度降低。同時，棉花種子生產(chǎn)環(huán)節(jié)多，也容易產(chǎn)生各種形式的機械混雜。另外，我國多數(shù)棉花生態(tài)區(qū)內(nèi)廣泛存在同一時期多種品種共存的現(xiàn)象，這樣就很可能造成品種間雜交，從而導(dǎo)致純度下降及品種退化現(xiàn)象。品種退化現(xiàn)象的突出表現(xiàn)是群體中異型株的增多［3］。隨著品種純度的下降，產(chǎn)量和經(jīng)濟性狀亦相應(yīng)下降。然而，品種混雜是否會對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性產(chǎn)生影響及其影響程度，這一問題前人尚未進行深入研究。本研究選用兩個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種GK12［4～6］和SGK321［7］都是具有自主知識產(chǎn)權(quán)，且在國內(nèi)應(yīng)用較廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種中，設(shè)置8種混雜比例，對品種混雜是否會對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性產(chǎn)生影響進行了系統(tǒng)分析。

1 材料與方法

1.1 實驗品種和試劑

選取本實驗室保存的轉(zhuǎn)Cry1Ab／Ac基因單價抗蟲棉花品種GK12及其受體泗棉3號；轉(zhuǎn)Cry1Ab／Ac、CpTI基因雙價抗蟲棉花品種SGK321及其受體石遠321。

Envirologix蛋白檢測試劑盒購自美國一龍公司；尿素、NaOH、無水乙醇等其他試劑均使用國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

分別于2008年、2009年在北京平谷試驗基地、河北廊坊試驗基地種植2個轉(zhuǎn)基因棉花品種，在轉(zhuǎn)基因品種中混雜非轉(zhuǎn)基因品種種子（其受體品種），共設(shè)置8種混雜比例，即100%、99%、97%，95%、90%、80%、50%和0%，每個比例設(shè)三個重復(fù)，種植田間管理同大田。待出苗長至3片真葉時，進行卡那霉素涂抹鑒定，卡那霉素鑒定濃度為1 mg／mL，按照預(yù)定混雜比例撥除多余植株。

1.3 抗性純度檢測

采用金標試紙條（重慶金標公司）方法檢測抗蟲基因的表達產(chǎn)物。隨機抽取樣品種子30粒進行檢測，三次重復(fù)。

1.4 外源基因的分子鑒定

采用改良CTAB方法［8，9］提取棉花基因組，對外源基因在棉花基因組中的拷貝數(shù)進行鑒定。采用通用引物進行PCR反應(yīng)，引物序列為：通用1：5′-CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC-3′；通用2：5′-CACCCACGATGTTACCGAGTG-3′。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應(yīng)所需酶及反應(yīng)底物等均購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應(yīng)擴增程序為：95℃5min；94℃1min，55℃1 min，72℃1.5 min，30個循環(huán)；72℃10 min。

1.5 殺蟲蛋白的測定

使用Envirologix試劑盒定量蛋白質(zhì)表達量。在苗期、蕾期、花期、鈴期4個棉花生育期間，隨機采集從頂端數(shù)第一片完全初展開頂葉、蕾期的頂葉和小蕾（直徑約0.5～0.7 cm）、花期的頂葉、小蕾和花器官、鈴期的頂葉、小蕾、花器官和小鈴（直徑約1.2 cm）置于密封袋中，用液氮速凍后置于冰盒內(nèi)，迅速帶回實驗室內(nèi)進行棉花抗蟲基因表達蛋白的檢測。在棉花生長的每個生育期，每個棉花品種隨機采樣量為10片（個），每10片（個）樣品混樣稱取0.1 g，各取三次，液氮冷凍后，按照Envirologix試劑盒提供的方法提取蛋白質(zhì)，在450 nm處測定其吸光值，根據(jù)標準曲線得出檢測數(shù)據(jù)。

1.6 室內(nèi)接蟲鑒定

室內(nèi)接蟲鑒定檢測技術(shù)參照農(nóng)業(yè)部953號公告檢測標準［10］進行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種純度和真實性鑒定

為了確保樣品的純度和轉(zhuǎn)基因品種的真實性，首先對樣品基因組進行Bt基因的分子鑒定。隨機抽取10份樣品，提取基因組進行檢測。Bt基因的PCR檢測結(jié)果見圖1，在1～10泳道都擴增出和陽性對照相同的大約600bp的條帶，證明樣品中含有Bt殺蟲基因；Southern雜交實驗分析轉(zhuǎn)基因品種中Bt基因在植物體內(nèi)的整合情況，結(jié)果見圖2，GK12中含有Bt基因，為7個拷貝；SGK321中也含有Bt基因，為2個拷貝。

圖1 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的PCR檢測的部分結(jié)果Fig.1 PCR of transgenic insect-resistant cotton.

圖2 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Southern雜交結(jié)果Fig.2 Southern blot of transgenic insect-resistant cotton.

2.2 殺蟲蛋白的時空表達

在確保獲得純度相對較高的樣品材料后，采用Envirologix試劑盒檢測Bt基因在GK12和SGK321中的時空表達水平，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，兩個品種的抗蟲蛋白表達均具有時空特異性。從時間上來看，兩個品種殺蟲蛋白的表達量基本呈現(xiàn)出前期表達量高，后期表達量低的趨勢，但葉和蕾在8月11日時有一個較高的峰值，隨后又表現(xiàn)出下降的趨勢。從空間上來看，兩個品種葉片中殺蟲蛋白的表達量最高，其次為蕾和花，鈴中殺蟲蛋白的表達量相對較低。比較BT

殺蟲蛋白在GK12和SGK321的表達量，發(fā)現(xiàn)無論是在葉、蕾、花，還是鈴中，SGK321中Bt殺蟲蛋白的表達量都高于GK12中Bt殺蟲蛋白的表達量。

圖3 GK12和SGK321中BT殺蟲蛋白的時空表達Fig.3 The spatial and temporal expression of BT insecticidal protein in GK12 and SGK321.

2.3 混雜比例與抗蟲性間的關(guān)系

混雜不同比例非轉(zhuǎn)基因種子的GK12和SGK321兩個品種的植株葉片危害等級與校正死亡率間表1。結(jié)果表明，隨著GK12和SGK321的種子純度逐漸降低——即混雜的非轉(zhuǎn)基因種子比例的升高，棉鈴蟲的危害等級逐漸升高，棉鈴蟲的死亡率逐漸降低。其中，GK12的危害等級由0.2上升到4.6，危害等級與種子純度間的相關(guān)系數(shù)為0.93，達到極顯著相關(guān)（P＜0.01）；棉鈴蟲校正死亡率也從97.67%下降到0，棉鈴蟲校正死亡率與種子純度間的相關(guān)系數(shù)為0.96，達到極顯著相關(guān)（P＜0.01）。SGK321的危害等級由0.3上升到4.8，危害等級與種子純度間的相關(guān)系數(shù)為0.94，達到極顯著相關(guān)（P＜0.01）；棉鈴蟲校正死亡率也從97.5%下降到0，棉鈴蟲校正死亡率與種子純度間的相關(guān)系數(shù)為0.99，達到極顯著水平（P＜0.01）。棉鈴蟲食喂轉(zhuǎn)基因抗蟲棉葉片時，雙價抗蟲棉SGK321比單價抗蟲棉GK12校正死亡率要高。由此可見，純度的下降對棉花的抗蟲性存在極顯著影響。

表1 GK12和SGK321不同混雜比例對葉片危害等級及校正死亡率的影響Table 1 The effect of seedsmixed proportion on bollworm damage level and corrected mortality of H.armigera larvae in GK12 and SGK321.

2.4 混雜比例與產(chǎn)量間的關(guān)系

轉(zhuǎn)基因品種的不同混雜比例對棉花產(chǎn)量有影響。結(jié)果表明，無論是GK12還是SGK321，產(chǎn)量均與種子純度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（圖4，表2）。其中，GK12的產(chǎn)量與種子純度間達到極顯著相關(guān)水平；SGK321的產(chǎn)量與種子純度間達到顯著相關(guān)水平。隨著轉(zhuǎn)基因品種種子純度的降低，混雜的非轉(zhuǎn)基因種子的比例升高，該品種的產(chǎn)量顯著降低。

解析產(chǎn)量降低的因素，發(fā)現(xiàn)主要是由于品種的混雜致使整個群體的株高下降，子葉始節(jié)升高，始果枝節(jié)位下降，果枝數(shù)減少，空果枝數(shù)增多，鈴數(shù)減少，單鈴重降低，品質(zhì)變劣，以至于最終產(chǎn)量大幅降低。混雜對于品種群體的特征特性影響隨著混雜程度的加深而越來越大，整個群體更易遭受棉鈴蟲的危害，導(dǎo)致棉結(jié)鈴率降低，空果枝數(shù)增高，單鈴重減小，最終產(chǎn)量大幅下降。從混雜比例來看，GK12中純度達97%時，與100%GK12在產(chǎn)量上的差異即達到顯著水平；SGK321中純度達95%時，與100%sGK321在產(chǎn)量中差異達到顯著水平，也就是說，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種抗性純度至少要達到97%，才可以保證產(chǎn)量不至于損失太大。

圖4 GK12和SGK321不同混雜比例對產(chǎn)量的影響Fig.4 The effect of seedsmixed proportion on cotton yields of GK12 and SGK321.

表2 GK12和SGK321不同混雜比例對產(chǎn)量影響的差異顯著性分析Table 2 Significance analysis of the effect f o seedsmixed proportion on cotton yields of GK12 and SGK321.

3 討論

品種的混雜嚴重影響著品種的農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和產(chǎn)量，直接影響了品種的生命力，加速了品種的退化。而造成品種混雜的原因很多，如機械混雜、人為混雜，自然混雜等，因此，應(yīng)當盡量避免品種混雜現(xiàn)象的發(fā)生。本文首次利用室內(nèi)生測，殺蟲蛋白檢測技術(shù)和農(nóng)藝性狀等方法相結(jié)合綜合分析了品種抗性純度對轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)量的影響，科學(xué)的論斷出轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種抗性的下降對于產(chǎn)量的影響是非常顯著的，單價抗蟲棉要比雙價抗蟲棉品種抗性純度要更為嚴格些，在今后的育種過程中，有意識的利用雙價抗蟲棉品種作為親本是很有必要的，不僅延緩了棉鈴蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性，而且提高了產(chǎn)量。在品種推廣過程中，盡量保證品種的純度至少要達到97%以上，在蟲害發(fā)生時期才可能保證產(chǎn)量不受較大的損失。

［1］ 張銳，王遠，孟志剛，等.國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究回顧與展望［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2007，9（4）：32-42.

［2］ 石躍進，袁鈞，潘轉(zhuǎn)霞，等.棉花的自花授粉與天然異交［J］.中國棉花，2001，28（1）：7-8.

［3］ 王瑛，張新建.淺談棉花品種退化的原因及對策［J］.種子世界，2005，8：32-33.

［4］ 郭三堆，崔洪志.中國抗蟲棉GFM Cry1A殺蟲基因的合成及表達載體的構(gòu)建［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2000，2（2）：21 -26.

［5］ 楊玉強，劉軍，楊瑞憲，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的進一步純合和選育［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2006，7：36.

［6］ 眭書祥，趙國忠，李愛國，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種質(zhì)資源GK12性狀與利用情況分析［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15（5）：61-64.

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［10］ 中華人民共和國國家標準.轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測抗蟲棉花第1部分：對靶標害蟲的抗蟲性［S］.農(nóng)業(yè)部953號公告-12.1-2007，2007-12-18.

Influence of Seed Purity on Insect Resistance and Yield in Transgenic Cotton

SUN Guo-qing1，2，ZHANG Rui1，WANG Yuan1，REN Mao-zhi1，MENG Zhi-gang1，ZHOU Tao1，CHEN Quan-jia2，QU Yan-ying2，GUO San-dui1*
1.Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；
2.College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China

The efficient and stable expression of exogenous insecticidal genes in transgenic cotton is the key of transgenic cotton application.In order to compare the insect-resistant effect of transgenic cotton under different seeds purity，two transgenic varieties GK12 and SGK321 were mixed with non-genetically modified cotton seeds in eight different proportion for evaluating insecticidal protein expression level，themolecular detection and indoor hygiene tests showed thatwith the decline in the purity of insect resistance，cotton bollworm damage level gradually increased，corrected mortality of H.armigera larvae decreased，varieties of insect-resistant capacity declined.The field experiments indicated thatwith the decline of the insect resistant purity，boll number reduced，the number of empty fruit branches increased，which ultimately led to a sharp decline in production，and thus gave rise to the so-called“Bt cotton is not insect resistant”.In conclusion，the decline of seed purity had significant effection on insect resistance and cotton yield.In order to ensure high yield，the purity of transgenic insect-resistant cotton should be higher than 97%.

insect resistance；yield；seed purity；transgenic cotton

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.06

2012-12-05；接受日期：2012-12-25

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項“轉(zhuǎn)基因耐旱耐鹽堿棉花新品種培育”（2011ZX08005-004）資助。

孫國清，助理研究員，博士，研究方向為植物基因工程。*通訊作者：郭三堆，研究員，從事棉花基因工程研究。E-mail：guosandui＠caas.cn