李雪虎，陸錫宏，辛志君，周 翔，梁劍平

(中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的重離子束輻照與傳統(tǒng)的紫外線、X射線和γ射線相比具有更高的傳能線密度(Line energy transfer，簡(jiǎn)稱(chēng) LET)、相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(RBE)和更尖銳的電離峰(Bragg峰)等特點(diǎn)，能夠在低傷害前提下得到較高的誘變率和較寬的突變譜，突變體更穩(wěn)定［1］，已廣泛應(yīng)用于作物改良和誘變育種。近年來(lái)，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所用重離子誘變育種技術(shù)開(kāi)展了多種植物材料的輻照研究，首次用重離子束輻照技術(shù)培育出“隴輻2號(hào)”小麥、大麗花、甜高粱和紫蘇等新品種［2-4］。

大青葉為十字花科植物菘藍(lán)的干燥葉，是一味常用中藥，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，用于溫邪入營(yíng)，高熱神昏，發(fā)斑發(fā)疹，黃疸，熱痢，痄腮，喉痹，丹毒，癰腫等［5］。臨床上則用作治療各種病毒性流行性感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等傳染性疾?。?］。隨著需求量的增大和對(duì)品質(zhì)要求的提高，價(jià)值越來(lái)越受到人們的關(guān)注。但栽培品種及產(chǎn)地氣候不同，產(chǎn)量和有效成分含量存在較大差異，且質(zhì)量不穩(wěn)定?，F(xiàn)有品種抗病性和抗蟲(chóng)性較差，個(gè)別產(chǎn)地品種退化嚴(yán)重。采用12C6+離子束進(jìn)行大青葉輻照育種的研究在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了不同劑量12C6+離子束輻照對(duì)苗期生理生化特性影響，為大青葉輻射育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

已經(jīng)過(guò)三個(gè)世代的純化試驗(yàn)大青葉種子，于4℃冰箱保存待用，植物種子標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所藥物研發(fā)中心。

1.2 輻照方法

輻照實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(HIRFL)生物輻照終端上進(jìn)行。初始能量為100 MeV/u的12C6+離子束經(jīng)過(guò)束流管道的鎳窗、電離室、空氣、降能片后照射樣品 (植物種子)，用空氣電離室監(jiān)測(cè)注入量，樣品更換和數(shù)據(jù)獲取均由計(jì)算機(jī)控制，全部過(guò)程在室溫和大氣環(huán)境條件下進(jìn)行，輻照劑量分別為20，40，50和 80 Gy，劑量率為10 Gy/min，沒(méi)有輻照的種子為對(duì)照。

1.3 幼苗培養(yǎng)

將不同劑量輻照處理的大青葉種子和對(duì)照組各100顆用紗布包好，用水浸泡過(guò)夜，75%酒精消毒2 min，用無(wú)菌水沖洗3次放入已滅菌的MS固體培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，1962)，每皿40粒，在室溫下晝夜交替培養(yǎng)。

1.4 生理生化指標(biāo)及其測(cè)定

幼苗培養(yǎng)4周后，用鏟子從盆缽中完整地挖出大青葉幼苗，洗凈并收集根系和幼苗，進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，各組統(tǒng)計(jì)20株，所有指標(biāo)測(cè)定每處理重復(fù)3次。具體指標(biāo)及測(cè)定方法如下。

1.4.1 根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法進(jìn)行［7，8］稱(chēng)取根系鮮樣1 g，浸沒(méi)于盛有0.4%TTC和66 mmol/L磷酸緩沖液的等量混合液10 mL的燒杯中，于37℃保溫3 h，然后加入1 mol/L硫酸2 mL終止反應(yīng)。取出根，小心擦干水分后與3 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研缽中充分研磨，過(guò)濾后將紅色的提取液移入10 mL容量瓶，定容至10 mL，于 485 nm處測(cè)定 OD值，求出 TTC的還原量。

1.4.2 丙二醛(malondialdehyde，簡(jiǎn)稱(chēng) MDA)含量的測(cè)定 MDA的檢測(cè)按照 Dhindsa等的方法［9］。MDA 含量(mmol/L)=6.45(OD532－OD600)－0.56×OD450［10］。

1.4.3 葉綠素含量采用李合生等的方法進(jìn)行［11］稱(chēng)取0.5 g新鮮幼苗葉片用丙酮浸提獲得色素提取液，然后以80%丙酮為對(duì)照，分別測(cè)定663 nm、645 nm處的光密度值。根據(jù)測(cè)量得到的光密度值代入公式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量。

1.4.4 酚酸類(lèi)化合物含量 酚酸類(lèi)化合物提取與測(cè)定參照文獻(xiàn)［12］的方法 以水楊酸為對(duì)照品。采用folin－ciocaiteu比色法;測(cè)定A763 nm處吸光度，根據(jù)線性方程求酚酸類(lèi)類(lèi)化合物含量。

1.4.5 酶活性測(cè)定 POD和 SOD提取:稱(chēng)取1 g幼苗，加入5 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿于4℃，4000 r/min離心15 min，收集上清液低溫保存?zhèn)溆?，測(cè)量提取液總體積［14］。還原型谷胱甘肽提取:稱(chēng)取1 g幼苗，置于研缽中，加入5 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的50 g/L三氯乙酸溶液(含5 mmol/L Na2-EDTA)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、10000 r/min離心20 min。收集上清液，測(cè)量提取液總體積［14］。酶液活性測(cè)定方法及藥品的配置均按照李玲等的方法［14］備用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)以上所獲得的數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 大青葉酚酸類(lèi)化合物含量

不同劑量的碳離子束輻照處理后，其大青葉內(nèi)酚酸類(lèi)化合物含量的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。0～80 Gy劑量范圍內(nèi)大青葉葉片內(nèi)酚酸類(lèi)化合物含量隨輻照劑量增大而增加，對(duì)照組酚酸類(lèi)含量為0.16 mg/mL，80 Gy時(shí)為0.24 mg/mL達(dá)最大;說(shuō)明不同劑量的重離子束輻照都有利于大青葉片內(nèi)酚酸類(lèi)化合物的積累。

圖1 碳離子輻照對(duì)酚酸類(lèi)化合物含量的影響Fig.1 Effect of12C6+ion irradiation on phenolic content

2.2 輻照對(duì)大青葉幼苗根系活力與生長(zhǎng)的影響

大青葉根系是吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，并進(jìn)行一系列有機(jī)化合物的合成反應(yīng)，對(duì)地上部的形態(tài)形成及新陳代謝過(guò)程起著極其重要的作用。不同輻照處理對(duì)大青葉幼苗根系活力的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，隨著劑量的增加大青葉根系TTC的還原強(qiáng)度均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。特別是80 Gy處理極顯著地降低大青葉的根系活力。由此表明，80 Gy高劑量輻照處理對(duì)大青葉幼苗根系活力產(chǎn)生較大的抑制作用。

圖2 碳離子輻照對(duì)根系活力的影響Fig.2 Effect of irradiation on root vigor of seedlings

2.3 大青葉可溶性糖含量

圖3是12C6+離子輻照對(duì)可溶性糖含量的影響，在0～40 Gy，含糖量隨輻照劑量增大大幅增加，對(duì)照組的可溶性糖含量為0.867%，40 Gy時(shí)為2.98%，為最大值;40～80 Gy間隨輻照劑量增大而下降。這表明大青葉的含糖量隨碳離子輻照劑量增大，但輻照劑量高于40 Gy不利于可溶性糖的積累。

圖3 碳離子輻照對(duì)可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of12C6+ion irradiation on soluble sugar content

2.4 葉綠素含量

光合作用是植物合成碳水化合物的一個(gè)重要生理過(guò)程，而葉綠素是植物光合作用的基礎(chǔ)。不同劑量的12C6+離子束輻照處理后，其大青葉片內(nèi)葉綠素a和葉綠素b含量的變化情況見(jiàn)圖4。兩種色素的變化趨勢(shì)基本一致，在0～50 Gy變化不大，略有降低，對(duì)照組葉綠素a和葉綠素b的含量分別為1.92和1.02 mg/g，50 Gy 時(shí)三者的含量分別為 1.71 和0.81 mg/g;到80 Gy色素含量降到最低分別為1.31和 0.60 mg/g。

圖4 碳離子輻照對(duì)葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of12C6+ion irradiation on chlorophyll content

2.5 大青葉丙二醛(MDA)含量

丙二醛(MDA)是植物受環(huán)境脅迫后引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化而產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其在細(xì)胞內(nèi)積累量與細(xì)胞膜氧化損傷的程度密切相關(guān)。MDA的含量變化反映了質(zhì)膜受損傷的程度。如圖5所示，隨著照劑量的增大，大青葉的MDA含量先升高，在40 Gy輻照處理組達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比升78%(P＜0.01);50和80 Gy輻照處理組的MDA含量有所降低，分別比對(duì)照組升高了 51.6%和 43.9%(P ＜0.01)。

圖5 碳離子輻照對(duì)MDA含量的影響Fig.5 Effect of12C6+ion irradiation on MDA content

2.6 大青葉細(xì)胞抗氧化酶活性

不同劑量12C6+離子束輻照組的大青葉SOD活性均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖6)。隨著0，20，40，50和80 Gy輻照劑量的增高，輻照組SOD活性先增高后降低，在40 Gy時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照組的138%(P＜0.01)。50和80 Gy輻照組的POD活性有所升高，但仍明顯高于對(duì)照組。如圖6所示。

圖6 碳離子輻照對(duì)SOD活性的影響Fig.6 Effect of12C6+ion irradiation on SOD content

12C6+離子束輻照處理大青葉的POD活性隨輻照劑量增大呈先增后降的類(lèi)“拋物線”趨勢(shì)(圖7)，40 Gy 時(shí) SOD 活性達(dá)最大值(93.6 μg/g)，這表明碳離子輻照有利于提高SOD活性的積累。

圖7 碳離子輻照對(duì)POD活性的影響Fig.7 Effect of12C6+ion irradiation on POD content

3 討論

輻射誘變育種首先要確定適宜的輻照劑量，才可獲得有效的誘變。一般而言，隨著輻照劑量的增加，突變頻率也會(huì)相應(yīng)的提高，但過(guò)高的劑量會(huì)干擾生物體正常的代謝，增加畸變率［16，17］。同時(shí)，每種生物體都有自身的生物學(xué)特性，它們對(duì)輻照處理的敏感性也各不相同。因此，開(kāi)展大青葉干種子的輻照敏感性試驗(yàn)是非常必要的，它是開(kāi)展大青葉輻射育種的基礎(chǔ)。

在逆境條件下，植物體內(nèi)可溶性糖會(huì)積累，以降低滲透勢(shì)和冰點(diǎn)，適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化，可溶性糖含量的變化在一定程度上可反映植物的抗逆性［2］。本實(shí)驗(yàn)中，大青葉可溶性糖含量都有明顯積累，在40 Gy時(shí)達(dá)最大值，而50和80 Gy時(shí)反而下降。這可能是因?yàn)橹仉x子束作為一種新型的誘變?cè)?，有較大的能量和質(zhì)量沉積效應(yīng)。當(dāng)帶有一定電荷態(tài)的重離子作用于種胚時(shí)，其物理、化學(xué)和生物學(xué)綜合作用有可能引發(fā)種胚的突變［18］，進(jìn)而導(dǎo)致植物相關(guān)生理特性發(fā)生不同程度的改變。

植物體內(nèi)有許多酚酸類(lèi)化合物，它們有抗氧化和抗菌等多種生理功能［19］。多酚在植物生理、生態(tài)上，尤其是抗蟲(chóng)生理中也發(fā)揮著重要作用［20］。本研究中，0～80 Gy劑量范圍內(nèi)大青葉內(nèi)酚酸類(lèi)化合物含量隨輻照劑量增大而增加，這可能是由于在中、低劑量重離子對(duì)樣品產(chǎn)生的傷害小［21］，有刺激效應(yīng)，引發(fā)種胚發(fā)生突變，提高了它的抗逆性、抗氧化和抗病蟲(chóng)害能力。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，植物體內(nèi)自由基的積累首先攻擊膜系統(tǒng)，使得膜脂脂肪酸的不飽和鍵被氧化，造成MDA含量的增加，損傷膜結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡，產(chǎn)生MDA，其積累量反映了植物受逆境傷害的程度［22-23］。本研究中，輻照處理組的MDA含量明顯高于對(duì)照組，產(chǎn)生大量 MDA，處理劑量40 Gy時(shí)，MDA含量高于對(duì)照.輻照劑量為40～80 Gy，MDA含量呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明低劑量C離子輻射對(duì)生物膜造成損傷，中能重離子束輻照對(duì)大青葉能產(chǎn)生一定傷害，輻照劑量增大則可激活相關(guān)保護(hù)酶系統(tǒng)，減輕了重離子束輻照對(duì)自身的傷害。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)狀況和活力水平直接影響植株生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。根系活力大小一定程度上反映了植株吸收養(yǎng)分能力的強(qiáng)弱［24］。武振華等［3］研究發(fā)現(xiàn)，12C6+離子束輻照紫蘇種子后植株矮化、成活率降低。司婧等［1］發(fā)現(xiàn)輻照組的種子正常萌發(fā)后，其幼根停止生長(zhǎng)，幼苗和幼根逐漸腐爛導(dǎo)致死亡，推測(cè)番茄種子根生長(zhǎng)點(diǎn)是重離子輻照的敏感區(qū)域。本研究中也發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加大青葉根系活力均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，充分證明了輻照損傷主要抑制了根的生長(zhǎng)。輻照大青葉片內(nèi)色素類(lèi)化合物葉綠素a、葉綠素b等隨輻照劑量增大而略有降低，在葉片顏色上呈現(xiàn)暗綠，推斷是根受到損傷從而造成植株?duì)I養(yǎng)不良所致。

SOD和POD是植物體內(nèi)2種重要的膜保護(hù)酶，能對(duì)細(xì)胞的傷害作出響應(yīng)，同時(shí)消除自由基產(chǎn)生的傷害而起保護(hù)作用，對(duì)維持植物細(xì)胞自由基處于較低水平有重要作用。因此可認(rèn)為，相應(yīng)酶系的活性可作為作物輻照敏感性的測(cè)定指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明SOD活性表現(xiàn)為先上升后降低，處理劑量為20～40 Gy，二者活性逐漸增大，在40 Gy處有最大值，后又隨輻照劑量增大，活性顯著下降。這與周利斌等［25］(80 MeV/u的12C6+離子和50 keV的電子輻照沙打旺干種子)和薛林貴等［2］(12C6+離子束輻照紫蘇)的研究結(jié)果中MDA含量變化趨勢(shì)相同，都表現(xiàn)為先上升后降低。

總之，碳離子束輻照大青葉種子有利于大青葉中的可溶性糖、丙二醛和酚酸類(lèi)類(lèi)化合物含量的積累，40 Gy左右的輻照劑量有利于酚酸類(lèi)化合物及抗逆性物質(zhì)的積累。對(duì)大青葉抗逆性的提高和新品種的選育有重要意義。在輻射育種的后續(xù)研究中，還可將現(xiàn)代分子生物學(xué)研究技術(shù)引入到誘變育種工作中，以提高對(duì)有利變異的篩選與利用效率。

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