張光孜劉文志* 高海德柳仲林李興中

（1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外5科，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001；3 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116001）

檢測(cè)化療藥聯(lián)合TRAIL后對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞的影響

張光孜1劉文志2* 高海德3柳仲林3李興中3

（1 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外5科，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001；3 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116001）

目的 探討化療藥聯(lián)合 TRAIL 后對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞存活和凋亡的影響。方法 單純用化療藥抑制腸癌細(xì)胞為對(duì)照組，化療藥聯(lián)合TRAIL 抑制腸癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，兩組均用 MTT 法測(cè)定存活率和 Annexin V/PI 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的腸癌細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，而凋亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異 P ＜ 0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 化療藥聯(lián)合 TRAIL 能有效降低抑制胃腸道腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡，降低存活率，提高凋亡率。

化療藥；TRAIL；胃腸道腫瘤細(xì)胞

近年來，腫瘤患病率逐年升高，其產(chǎn)生的癥狀對(duì)患者的身體質(zhì)量水平產(chǎn)生嚴(yán)重影響。提高化療藥物的靶向性，降低其臨床產(chǎn)生的毒性，已經(jīng)成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)[1]。TRAIL是在研究腫瘤性質(zhì)細(xì)胞、病毒感染性細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種可以促進(jìn)以上細(xì)胞不斷病變壞死，而對(duì)人體內(nèi)正常細(xì)胞卻無產(chǎn)生較明顯毒性消極作用。本文檢測(cè)化療藥聯(lián)合TRAIL后對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞的影響，取得滿意的結(jié)果，現(xiàn)將具體過程報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腸癌細(xì)胞組織由我院腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)室提供；化療藥替吉奧由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字為H20100151；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）5μg/mL由上海彩佑生物化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 腸癌細(xì)胞株培養(yǎng)方法

將腸癌細(xì)胞株置入含有新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，其中，新生牛血清的濃度為10%，培養(yǎng)液溫度控制在37℃左右進(jìn)行恒溫條件下培養(yǎng)，CO2濃度含量控制在5%，培養(yǎng)箱中濕度需充分飽和。選取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腸癌細(xì)胞置入經(jīng)一定濃度稀釋后的培養(yǎng)液并在培養(yǎng)板中接種，培養(yǎng)板共96孔，一孔200μL，平均每孔含癌細(xì)胞量為5×103個(gè)，注意培養(yǎng)液環(huán)境條件與細(xì)胞株保持一致，并將培養(yǎng)板分為為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組三份。其中對(duì)空白組加入RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)一步培養(yǎng)，對(duì)照組加入化療藥替吉奧，實(shí)驗(yàn)組加入化療藥聯(lián)合TRAIL，三組皆繼續(xù)培養(yǎng)20h。

1.2.2 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

三組培養(yǎng)液皆加入MTT含量為20μL后繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)液上清部分吸去后，加入DMSO用量200μL，震蕩5min，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，在電子顯微鏡下統(tǒng)計(jì)活的癌細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算存活率，對(duì)照組癌細(xì)胞存活率=（活的癌細(xì)胞數(shù)量 / 總的癌細(xì)胞數(shù)量）×100%。重復(fù)三次，取均數(shù)。

1.2.3 Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)期細(xì)胞培養(yǎng)板，收集懸浮細(xì)胞：0.25%胰酶及0.02%EDTA（1∶1）收集消化貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞，離心，吸去上清培養(yǎng)液，預(yù)冷洗滌細(xì)胞。重新懸浮細(xì)胞，濃度控制在2 ×106/mL左右。然后取300μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和10μLPI溶液混勻。室溫在避光孵育15min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，重復(fù)三次，取均數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文研究所得的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，差異P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

相對(duì)僅采取單純化療藥治療的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的腸癌細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，而凋亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，產(chǎn)生差異明顯，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組抑制率和凋亡率

3 討 論

腫瘤疾病是由于人體體內(nèi)在致癌因子發(fā)生作用使癌細(xì)胞突然性大量復(fù)制增生，基因的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控力功能消失導(dǎo)致病變細(xì)胞累積的一種頑癥，若形成惡性的腫瘤將成為癌癥[2]。目前臨床上治療腫瘤的有效方法是直接切除病灶組織和化療，大部分患者為減少開刀痛苦一般傾向化療治療。但化療藥物存在嚴(yán)重的毒副作用以及其耐藥性高，給臨床資料帶來了很大的困難，研究其提高其靶向性和降低耐藥性是抗腫瘤方向的研究熱門。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL）屬于II 型跨膜蛋白質(zhì)，是Wiley等從人心肌cDNA文庫中克隆出來的。TRAIL有4種受體，死亡受體DR4、DR5， 誘捕受體DCR1、DCR2。TRAIL通過與死亡受體結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活半胱-天冬氨酸蛋白酶（ cys-teine containing asparate specific protease，Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中Caspase 8為啟始Caspase。它的氨基酸含有腫瘤病變因子的結(jié)構(gòu)特征，具有誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞以及EB 病毒轉(zhuǎn)化形成異樣的人體淋巴細(xì)胞并促進(jìn)其凋亡的能力。此外，TRAIL 還具備有通過誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤類別細(xì)胞或病毒類別細(xì)胞并且能不斷促進(jìn)新生細(xì)胞凋亡，且可以發(fā)生的部位即可以在人體外也可以在人體內(nèi)，速度快，數(shù)量巨大。在目前階段已經(jīng)有許多國(guó)外學(xué)者出現(xiàn)使用TRAIL聯(lián)合順鉑或依托泊試對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行處理的研究，結(jié)果表現(xiàn)出TRAIL聯(lián)合順鉑或依托泊試可以增強(qiáng)其誘導(dǎo)凋亡能力[3]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道了TRAIL 聯(lián)合氟尿嗜嚨處理結(jié)腸癌細(xì)胞聯(lián)合阿霉素或者絲裂霉素處理肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究[4]。

本文研究中，對(duì)照組采用單純化療藥替吉奧抑制腸癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組采用化療藥替吉奧聯(lián)合TRAIL抑制腸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的腸癌細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組的存活率，但在凋亡率方面明顯高出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，且產(chǎn)生的差異明顯均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果說明聯(lián)合應(yīng)用TRAIL與化療藥對(duì)抑制及誘導(dǎo)胃腸道腫瘤細(xì)胞凋亡具有顯著的協(xié)同作用。

綜上所述，化療藥聯(lián)合TRAIL能有效降低抑制胃腸道腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡，降低胃腸道腫瘤細(xì)胞的存活率，提高凋亡率。

[1]王宏艷,常瑛.重組可溶性TRAIL聯(lián)合化療藥誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞凋亡[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(3):364-365.

[2]佟海俠,馬力,金紅麗,等. TRAIL聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的研究[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,25(4):348-349.

[3]Alaimo A,Gorojod RM,Kotler ML.The extrinsic and intrinsic apoptotic pathways are involved in manganese toxicity in rat astrocytoma C6 cells[J].neurochem Int,2011,59(2):297-308.

[4]佟海俠,張繼紅,陸春偉,等.IFNr、TRAIL及化療藥聯(lián)合誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2007,15(2):157-159.

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：1671-8194（2013）08-0163-02

*通訊作者：E-mail:zgz760@163.com