劉秉春，崔新潔，羅新松，王瀟

1 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021

2 湖南省血吸蟲病防治研究所，湖南岳陽 414000

日本血吸蟲病是一種流行廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。如何有效控制和預(yù)防日本血吸蟲成為全世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。研制血吸蟲病疫苗可作為化療的補(bǔ)充，能更有效地控制血吸蟲感染。近年來己經(jīng)開展了血吸蟲DNA疫苗的研制，并且取得了一定的效果，但其免疫保護(hù)效果還是很不理想。如何增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫效果是當(dāng)前日本血吸蟲疫苗研究的重點(diǎn)[1-2]。聯(lián)合運(yùn)用性質(zhì)不同的核酸疫苗和重組蛋白疫苗進(jìn)行免疫接種可以同時(shí)增強(qiáng)DNA 疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，如上調(diào)抗體水平、細(xì)胞增殖反應(yīng)、CTL 活性及細(xì)胞因子的分泌等，從而有效地提高疫苗效果[3-5]。本課題組前期研究工作表明，單一構(gòu)建SjGST-32的核酸疫苗和蛋白疫苗均難以同時(shí)誘導(dǎo)高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究將構(gòu)建的 VR1012-SjGST-32 DNA 疫苗免疫小鼠，然后用相應(yīng)用蛋白rSjGST-32疫苗加強(qiáng)免疫，探討DNA 初免-蛋白加強(qiáng)的聯(lián)合免疫策略是否能增強(qiáng)血吸蟲DNA疫苗的免疫保護(hù)效果，為研制高效抗血吸蟲疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

大腸桿菌DH5α、載體VR1012以及編碼谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶和組織蛋白酶B 二價(jià)核酸疫苗VR1012-SjGST-32和相應(yīng)重組蛋白rSjGST-32為本實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗小鼠IgG-HRP、TMB、MTT、刀豆蛋白(Con A)、牛血清白蛋白(BSA)、莫能菌素、多聚甲醛和皂素均為Sigma 公司產(chǎn)品；IL-4、IFN-γ、CD4、IL-10熒光單克隆抗體和Fc抗體購自BD 公司；胎牛血清和RPMI-1640為GIBCO 公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57/B6小鼠，6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，試驗(yàn)動(dòng)物均用無病源污染的飼料及飲水飼養(yǎng)。

1.2 抗原的制備與鑒定

將實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒VR1012-SjGST-32轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用限制內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒的正確性，經(jīng)發(fā)酵后通過堿裂解法大量制備重組質(zhì)粒，?20℃保存?zhèn)溆?；重組rSjGST-32蛋白抗原的制備參考分子克隆試驗(yàn)手冊，用Bradford 法進(jìn)行蛋白定量后?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物免疫及攻擊感染

將6～8周齡C57/B6雌性小鼠隨機(jī)分成A、B、C、D、E 5組，每組10只：A 組(PBS 對照組)、B 組(空質(zhì)粒VR1012對照組)、C 組(核酸疫苗VR1012-SjGST-32組)、 D 組(蛋白疫苗rSjGST-32組)、E 組(聯(lián)合免疫VR1012-SjGST-32+rSjGST-32組)。VR1012空質(zhì)粒及核酸疫苗100μg/次、蛋白疫苗50μg/次，各組均于0 d、14 d、28 d 采用肌肉多點(diǎn)注射免疫3次(聯(lián)合免疫組0 d、14 d 為核酸疫苗，28 d 為蛋白疫苗)。末次免疫后2周，每鼠經(jīng)腹部皮膚感染(30±2)條日本血吸蟲(大陸株)尾蚴。攻擊感染45 d 后剖殺小鼠，肝門靜脈灌注法收集成蟲。從固定部位取小鼠肝組織1 g，加入20 mL 5%的KOHL，于37℃孵箱中消化過夜，取0.1 mL 在普通光鏡下進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)。

減蟲率(%)=(對照組平均檢獲成蟲數(shù)?實(shí)驗(yàn)組平均檢獲成蟲數(shù))/對照組平均檢獲成蟲數(shù)×100%。

減卵率(%)=(對照組每雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù)?實(shí)驗(yàn)組每雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù))/對照組每雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù)×100%。

1.4 鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑及蟲卵肉芽腫的面積檢測

攻擊感染后45 d 剖殺小鼠，從固定部位切取小鼠肝組織，用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片和HE 染色，低倍鏡下觀察其病理學(xué)變化，并應(yīng)用Motic 照相處理軟件和病理圖像分析系統(tǒng)，測量各組鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑和蟲卵肉芽腫面積。

1.5 血清總IgG 的檢測

用重組蛋白rSjGST-32抗原包被ELISA 板，以末次免疫后14 d 小鼠血清為一抗，以酶標(biāo)羊抗鼠IgG 為二抗，間接ELISA 法檢rSjGST-32特異性IgG 水平。

1.6 MTT 法檢測T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

末次免疫后7 d，無菌條件下分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，通過尼龍柱除去B 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個(gè)/mL，活細(xì)胞數(shù)在90%，每孔加入100μL 細(xì)胞懸液到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。其中實(shí)驗(yàn)組為加100μL 日本血吸蟲抗原至終濃度為5μg/mL，陽性對照為加100μL ConA 至終濃度為5μg/mL，無關(guān)對照為加100μL BSA 至終濃度為2μg/mL，空白對照物為100μL RPMI-1640。實(shí)驗(yàn)組和對照組各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)48～72 h 后，每孔加入20μL 5μg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入100μL DMSO，培養(yǎng)15 min 后，用酶標(biāo)儀測定A570吸光值。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力用刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)SI =(A 實(shí)驗(yàn)組?A 培養(yǎng)基)/(A 細(xì)胞?A 培養(yǎng)基)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平

末次免疫后7 d，無菌條件下分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，通過尼龍柱除去B 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×106個(gè)/mL ，每孔加入100μL 細(xì)胞懸液到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。實(shí)驗(yàn)組：加日本血吸蟲抗原和抗CD28抗體，每孔各50μL 至終濃度為5μg/mL；陽性對照組：加100μL PMA 至終濃度為5μg/mL，空白對照組：加100μL RPMI-1640。實(shí)驗(yàn)組和對照孔各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h 后，離心收集細(xì)胞，用抗Fc 抗體封閉，加4%多聚甲醛固定8 min，0.1%皂素破膜5 min，PBS 洗2次，用10μL 熒光單克隆抗體4℃暗處染色30 min 后，取300μL 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲體的收獲及減蟲率的計(jì)算

攻擊感染后45 d 剖殺小鼠，各免疫組的蟲荷數(shù)及減蟲率見表1，聯(lián)合免疫組的減蟲率達(dá)42.92%，而DNA 單獨(dú)免疫組或蛋白單獨(dú)免疫組的減蟲率分別為31.15%和22.68%。聯(lián)合免疫組和單獨(dú)DNA 疫苗組或單獨(dú)蛋白疫苗組相比，差異顯著，但單獨(dú)免疫組之間的蟲荷數(shù)無顯著差異。

2.2 蟲卵的收獲及減卵率的計(jì)算

各組小鼠肝組織中每條雌蟲平均產(chǎn)卵數(shù)及減卵率見表2。如表所示，聯(lián)合免疫組的減卵率(57.98%)與DNA單獨(dú)免疫組(39.58%)或蛋白單獨(dú)免疫組(37.09%)相比差異顯著，但單獨(dú)免疫組減卵率無顯著差異。

2.3 鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑及蟲卵肉芽腫的面積測定結(jié)果

表3顯示各組肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑及蟲卵肉芽腫的面積測定結(jié)果，聯(lián)合免疫組的蟲卵肉芽腫平均直徑及蟲卵肉芽腫的與DNA 單獨(dú)免疫組和蛋白單獨(dú)免疫差異顯著。

表1 各組檢獲成蟲數(shù)和減蟲率Table 1 Worm burden and worm reduction rate in immunized mice compared with the control

表2 各組平均每克肝組織蟲卵數(shù)及減卵率Table 2 Eggs per gram of liver tissue and egg reduction rate of groups

表3 鼠肝臟蟲卵肉芽腫平均直徑和肉芽腫的面積結(jié)果Table 3 Mean areas of single-egg granulomas and the mean areas occupied by granulomas in liver sections

2.4 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

為了檢測各種疫苗免疫后細(xì)胞免疫反應(yīng)，在末次免疫后7 d，無菌取出脾臟，通過MTT 法進(jìn)行T 細(xì)胞擴(kuò)增檢測，ConA 用于所有的實(shí)驗(yàn)組中作為陽性對照，rSjGST-32抗原來刺激T 細(xì)胞增殖，而BSA 作為非特異性抗原。如圖1所示，DNA 初免-蛋白加強(qiáng)免疫組T 細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著高于單獨(dú)免疫DNA 疫苗組和單獨(dú)免疫蛋白疫苗組。

2.5 血清總IgG 的檢測

以r SjGST-32蛋白作為檢測用抗原，包被ELISA 板，間接ELISA 法對末次免疫后14 d 收集的小鼠血清中的IgG 進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示，聯(lián)合免疫組抗體IgG 滴度顯著高于DNA 疫苗組，但與單獨(dú)免疫蛋白疫苗組，無顯著差異。

圖1 T 淋巴細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果Fig.1 T cell proliferation.

圖2 間接ELISA 檢測IgG 滴度Fig.2 IgG titer in different groups.

2.6 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

細(xì)胞因子的表達(dá)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和免疫平衡過程中起到重要作用，為進(jìn)一步檢測聯(lián)合免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的變化情況，在末次免疫后7 d，分離各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)因子染色，用流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，DNA疫苗初免-蛋白疫苗加強(qiáng)的免疫策略顯著增強(qiáng)了抗原特異性 CD4+IFN-γ+的產(chǎn)生，而降低了CD4+IL-10+的產(chǎn)生，提示為Th1型免疫應(yīng)答。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子Fig.3 Antigen-specific cytokines profiles by FACS.Intracellular staining for IFN-γ+ in CD4+(A) and IL-4 in CD4+(B)IL-10 in CD4+(C) in cells was performed.The percentages of positive cells were showed in each dot-plot in the gated area.D is a representation of the percentage of intracellular cytokines of each group.The data shown are representative of three independent experiments.*P <0.05.

3 討論

雖然DNA 疫苗能誘導(dǎo)全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而且能引起長期的免疫記憶。然而，DNA疫苗誘導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主，抗體水平較弱，保護(hù)效果不夠理想[6-7]?；蚬こ虡?gòu)建的重組蛋白疫苗一般均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，但其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平常顯不足，保護(hù)效果有限[8-10]。許多研究者認(rèn)為，采用核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合免疫可發(fā)揮兩種疫苗在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的不同優(yōu)勢，從而增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的效果。近年來，在布魯桿菌病、瘧疾、弓形蟲病、日本腦炎、結(jié)核病和艾滋病等疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)，用核酸疫苗初免繼而用相應(yīng)蛋白疫苗加強(qiáng)免疫后，其免疫應(yīng)答水平和保護(hù)性免疫效果均較單一核酸疫苗或單一蛋白疫苗增高[11-14]。

血吸蟲疫苗追求的目標(biāo)主要有3個(gè)，第一是能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的感染免疫保護(hù)力，表現(xiàn)在減蟲率指標(biāo)上。本實(shí)驗(yàn)用日本血吸蟲 DNA 疫苗VR1012-SjGST-32與重組蛋白疫苗rSjGST-32聯(lián)合免疫小鼠(核酸疫苗初免-蛋白疫苗加強(qiáng))，獲得了42.3%的減蟲率，與VR1012-SjGST-32單獨(dú)免疫(減蟲率為31.15%)和rSjGST-32聯(lián)合免疫(減蟲率為22.68%)相比，差異顯著，表明DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用有明顯的減蟲作用。其二是抗生殖力，表現(xiàn)為雌蟲產(chǎn)卵量的下降和卵胚發(fā)育的障礙[15-16]。本研究顯示，從減卵效果來看，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫組獲得了59.6%的減蟲率，與VR1012-SjGST-32單獨(dú)免疫(減蟲率為31.15%)和rSjGST-32聯(lián)合免疫(減蟲率為22.68%)相比，差異顯著，進(jìn)一步說明聯(lián)合免疫組除具有抗日本血吸蟲感染的功效外，也具有一定的抗生殖作用。其三是抗病理免疫保護(hù)力，表現(xiàn)在對蟲卵肉芽腫形成的抑制和肝纖維化的調(diào)節(jié)上。血吸蟲病的病變主要由蟲卵引起，蟲卵主要是沉著在宿主的肝及結(jié)腸腸壁等組織，所引起的肉芽腫和纖維化是血吸蟲病的主要病變，蟲卵肉芽腫與纖維化的形成是肝臟病理變化的基礎(chǔ)。蟲卵肉芽腫的形成是宿主對致病因子的一種免疫應(yīng)答。一方面通過肉芽腫反應(yīng)將蟲卵破壞清除，并能隔離和清除蟲卵釋放的抗原，減少血液循環(huán)中抗原抗體復(fù)合物的形成和對機(jī)體的損害；另一方面，肉芽腫反應(yīng)破壞了宿主正常組織，不斷生成的蟲卵肉芽腫形成相互連接的疤痕，導(dǎo)致干線型肝硬變及腸壁纖維化等一系列病變[17-21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合免疫組與單獨(dú)免疫組相比，小鼠肝臟病理變化明顯減輕，肉芽體積較小，炎癥反應(yīng)輕微，改善了由于蟲卵的沉積而造成的肝臟病理損害。

許多研究表明，血吸蟲疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)力依賴于CD4+T 淋巴細(xì)胞和IFN-γ的存在，IFN-γ激活的效應(yīng)性細(xì)胞是抵抗血吸蟲感染的主要機(jī)制[22]。在本研究中，我們用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的方法對CD4+IFN-γ+和CD4+L-10+進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與單獨(dú)DNA 免疫組或者單獨(dú)蛋白免疫組相比，DNA 疫苗初免-蛋白疫苗加強(qiáng)的免疫策略增強(qiáng)了抗原特異性CD4+IFN-γ+的產(chǎn)生，而降低了CD4+L-10+的產(chǎn)生，顯著地提高了Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，這可能與聯(lián)合疫苗可以在一定程度上提高動(dòng)物的保護(hù)效果有關(guān)。

研究結(jié)果初步證明：DNA 初免-蛋白加強(qiáng)的聯(lián)合免疫策略可以提高減蟲和減卵效果，而且在一定程度上減輕了肝臟的病理損害，其免疫保護(hù)效果可能與聯(lián)合免疫增強(qiáng)了抗原特異性CD4+IFN-γ+的產(chǎn)生有關(guān)，為探索日本血吸蟲病疫苗研制的新途徑和探討日本血吸蟲感染的保護(hù)性免疫機(jī)制提供有益的實(shí)驗(yàn)研究資料。

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