張國俊，徐明愷，孫健，李洪義，楊宏麗，張惠文，張成剛

1 中國科學(xué)院大學(xué)沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

3 沈陽協(xié)合生物制藥股份有限公司，遼寧沈陽 110179

金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一類典型的細(xì)菌超抗原，其一端結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(MHC Ⅱ)抗原結(jié)合槽的外側(cè)，另一端與TCR (T cell receptor，TCR)的Vβ鏈連接，在抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)外形成MHCⅡ類分子-Sag-TCR Vβ復(fù)合物，極低劑量即可活化T 細(xì)胞[1-4]，并釋放大量炎癥性因子[5]，因而在腫瘤和感染性疾病治療方面具有潛在應(yīng)用價值[6-7]。

按照血清型的不同，腸毒素可分為幾十類。其中C 型腸毒素(SEC)又可以進一步分為C1、C2和C3三種亞型，三種亞型之間的氨基酸序列高度保守[8]。金黃色葡萄球菌腸毒素 C2(Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)因為毒性較低已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，并取得一定的治療效果。但在臨床應(yīng)用中，也暴露出活性較差、單獨用藥治療效果欠佳等缺點。如能在保持低毒的前提下提高其活性將更具有臨床治療意義。而以基因工程技術(shù)對SEC2蛋白分子進行氨基酸理性定點改造，則是實現(xiàn)該目的的重要手段。

多數(shù)種類的腸毒素分子中都存在著一個由2個Cys 形成的含有十幾個氨基酸殘基的二硫環(huán)結(jié)構(gòu)。在SEC2分子中，二硫環(huán)結(jié)構(gòu)對于SEC2的活性和穩(wěn)定性都至關(guān)重要[9]。晶體學(xué)研究顯示，在C 類腸毒素中，二硫環(huán)內(nèi)部的氨基酸殘基可能介導(dǎo)了與TCR Vβ側(cè)鏈的結(jié)合[10]。Peter 等發(fā)現(xiàn)在SEC1中，當(dāng)102～106位氨基酸被WWT、WWP和WWH 取代后，突變體與TCR 結(jié)合能力提高150倍，并伴隨著T 細(xì)胞激活能力的顯著增強[11]。而SEC1與SEC2的序列高度保守，以上位點對SEC2具有怎樣的影響，該突變策略是否也適用于SEC2，活性改變的細(xì)胞學(xué)機制是什么，這是我們在本研究中所要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌Escherichia coli BL(DE3)由本實驗室保存；質(zhì)粒pET-28a 表達(dá)載體為Novagen 公司產(chǎn)品；重組質(zhì)粒pET-28a-sec2由本實驗室研究人員構(gòu)建；野生型SEC2蛋白純品由本實驗室表達(dá)純化[12]；小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；6～8周SPF 級BABL/c 雌性小鼠和新西蘭大白兔購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑和工具酶

T4 DNA 連接酶、蛋白分子量 Marker、Pyrobest DNA 聚合酶、核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ及DL2000 DNA 分子量Marker、RNAiso plus、PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ等均購自TaKaRa 大連公司；Ni-NTA 親和層析柱為Novagen 公司產(chǎn)品；卡那霉素、異丙基硫代-β-D 半乳糖苷(IPTG)、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均為Sigma 公司產(chǎn)品；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自 Hyclone 公司；胰蛋白酶為Gibico 公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨購自O(shè)XOID 公司、瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購于北京博大泰克生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子檢測試劑盒均購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成；DNA 測序由北京華大技術(shù)服務(wù)公司完成；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 突變基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建

將含重組質(zhì)粒pET-28-sec2的工程菌接種于含終濃度為60μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，取適量菌液提取含有sec2 DNA 片段的重組質(zhì)粒 pET-28-sec2。以pET-28-sec2質(zhì)粒為模板，應(yīng)用over-lap PCR 技術(shù)構(gòu)建突變基因st-1、st-2和st-3，over-lap PCR 引物見表1。突變體基因兩端PCR 擴增程序1：95℃變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min ，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，兩片段產(chǎn)物混合，4℃保存。突變體基因全長PCR 擴增程序2：95℃變性5 min；95℃40 s，50℃40 s，72℃2 min ，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將上述得到的突變基因片段經(jīng)切膠純化后用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pET-28a 進行過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含60μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并將陽性克隆進行測序。

1.2.2 突變蛋白的表達(dá)與純化

接種測序正確的陽性克隆菌 E.coli BL21(DE3)于LB 液體培養(yǎng)基中(含60μg/mL卡那霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600達(dá)到0.5。加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)物于30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后5000 r/min離心10 min 收集菌體，菌體用平衡緩沖液(10 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl，50 mmol/LNaH2PO4，pH 8.0)重懸后進行超聲波破碎。破碎產(chǎn)物于12000 r/min 離心20 min，收集上清,并上樣到Ni 離子親和層析柱(平衡緩沖液預(yù)處理)，以50 mmol/L 咪唑的平衡緩沖液清洗雜蛋白，50～250 mmol/L 咪唑的平衡緩沖液梯度洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰組分，洗脫液于透析液(PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.4 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)中充分透析除鹽，獲得純化蛋白，以15% SDS-PAGE 分析其純度。純化的突變蛋白按照Super-Bradford 蛋白定量試劑盒測定方法測定蛋白濃度。過濾除菌后保存于?70℃待用。

表1 構(gòu)建SEC2突變蛋白over-lap PCR 引物Table 1 Primers for constructing SEC2 mutant protein by over-lap PCR

1.2.3 突變蛋白體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性測定

無菌條件下取6～8周雌性BABL/c 小鼠脾臟剪碎研磨過200目細(xì)胞篩，紅細(xì)胞裂解液裂解去除紅細(xì)胞，用無血清RPMI 1640清洗獲得純的小鼠脾淋巴細(xì)胞。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×106cells/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再加入經(jīng)梯度稀釋后的ST-1、ST-2和ST-3及野生型SEC2蛋白，使終濃度分別為10 ng/mL、100 ng/mL 和1000 ng/mL。每孔終體積為200μL，血清濃度為10%。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以RPMI 1640培養(yǎng)基作陰性對照。

將上述培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱以37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。待培養(yǎng)時間結(jié)束后，向各細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入30μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1000 r/min 離心10 min，棄上清，每孔加入120μL DMSO 并在室溫振蕩10 min 溶解結(jié)晶顆粒。通過酶標(biāo)儀以測定波長570 nm 和參比波長630 nm 測定各實驗孔的吸光值(OD)。以增殖指數(shù)(Proliferation index，PI)表示刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，PI=實驗組吸光值/陰性對照組吸光值。

1.2.4 突變蛋白體外抗腫瘤活性測定

將小鼠脾淋巴細(xì)胞以5×105cells/孔加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， Hepa1-6腫瘤細(xì)胞以2.5×105cells/孔加入各孔，ST-1、ST-2和ST-3突變蛋白和野生型SEC2均以終濃10 ng/mL、100 ng/mL 和1000 ng/mL 加入各孔至終體積為200μL。同時設(shè)淋巴細(xì)胞本底釋放孔(加與實驗孔等量的淋巴細(xì)胞和蛋白樣品)，腫瘤細(xì)胞對照孔(僅加Hepa1-6腫瘤細(xì)胞)及空白對照孔(僅加RPMI 1640)。以牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照，每樣設(shè)3個重復(fù)。細(xì)胞于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，向各實驗孔加入30μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液并繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，1000 r/min 離心10 min，棄上清，每孔加入120μL DMSO 并在室溫振蕩10 min 溶解結(jié)晶顆粒。通過酶標(biāo)儀以測定波長570 nm 和參比波長630 nm 測定各實驗孔的吸光值(OD)。各蛋白的抑瘤水平用抑瘤率表示。

抑瘤率(Tumor growth inhibition%)=100?[(實驗孔?淋巴細(xì)胞本底釋放孔)/(腫瘤細(xì)胞對照孔?空白對照孔)]×100。

1.2.5 突變蛋白體內(nèi)致熱活性的檢測

將新西蘭大白兔固定于測溫儀上，對其體溫進行4 h 連續(xù)監(jiān)測。監(jiān)測期間篩選溫度波動范圍在38.6℃～39.5℃之間的實驗動物用于致熱活性的檢測。對試驗動物分組，每組3只，按照10μg/kg 體重的劑量通過耳緣靜脈注射實驗動物，無菌PBS 作為陰性對照。用直腸溫度測量儀連續(xù)監(jiān)測給藥之后至4 h 試驗動物的溫度變化，最終體溫變化差值以測定溫度減去初始溫度值表示，變化差值超過0.5℃被認(rèn)為有發(fā)燒效應(yīng)[13]。

1.2.6 突變蛋白體外刺激小鼠 T 細(xì)胞 TCR mVβ8.2基因的表達(dá)變化

按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞48 h，1000 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，重懸于1 mL RNAiso plus 中提取總RNA。以0.5μg RNA 為模板按 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。ABI7000型熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)檢測小鼠TCR mVβ8.2基因的表達(dá)水平，擴增引物：β-actin forward (5′-TACCACTGGCATCGTGATG GACT-3′)和β-actin reverse (5′-TCCTTCTGCAT CCTGCGGCAAT-3′)[14]；mVβ8.2 forward (5′-CA TTATTCATATGGTGCTGGC-3′)和mVβ8.2 reverse (5′-GCCAGAAGGTAGCAGAGACCC-3′)(Sempowski Lab 2006)，反應(yīng)體系按照 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ反應(yīng)液配制說明配制。檢測樣品做3個重復(fù)，且至少3次獨立重復(fù)實驗。擴增程序為：95℃變性5 min；95℃15 s，60℃45 s，72℃45 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min，數(shù)據(jù)分析通過待測基因與內(nèi)參基因Ct 值的差值來計算基因表達(dá)差異，即基因表達(dá)水平變化倍數(shù)=2－［(干預(yù)后待測基因－干預(yù)后參照基因)－(干預(yù)前待測基因－干預(yù)前參照基因)］。

1.2.7 突變蛋白體外刺激小鼠T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平

含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整小鼠脾淋巴細(xì)胞，以1×107cells/mL 加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再分別加入ST-1、ST-2和ST-3及野生型SEC2蛋白，使終濃度為1000 ng/mL，每孔終體積為1 mL。每種突變體設(shè)3個復(fù)孔，以RPMI 1640培養(yǎng)基作陰性對照。細(xì)胞于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，1000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA 方法測定IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量。ELISA 操作步驟按照北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司小鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒操作說明操作。

1.2.8 統(tǒng)計分析

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，每個樣品至少3次重復(fù)實驗，每個試驗至少3次獨立重復(fù)實驗。采用t 檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 SEC2突變蛋白的構(gòu)建及表達(dá)純化

通過over-lap PCR擴增，獲得分別編碼ST-1、ST-2和ST-3的突變基因st-1、st-2和st-3。經(jīng)酶切后與表達(dá)載體pET-28相連，構(gòu)建成含有突變基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28-st-1、pET-28-st-2、pET-28-st-3。經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并對陽性克隆進行DNA 測序驗證，證明表達(dá)載體構(gòu)建成功。突變蛋白表達(dá)工程菌經(jīng)破碎、親和層析純化后獲得突變蛋白純品，經(jīng)15%的SDS-PAGE 電泳檢測純度達(dá)到95%以上(圖1)，可用于后續(xù)實驗。

2.2 SEC2突變蛋白刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖活性

圖1 SDS-PAGE 電泳檢測SEC2突變蛋白的表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purification of SEC2 mutants analyzed by SDS-PAGE.1:ST-1;2:ST-2;3:ST-3;M:protein marker.

通過MTT 法檢測野生型SEC2以及ST-1、ST-2和ST-3突變蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性。作為一種超抗原，微量SEC2即可有效激活淋巴細(xì)胞群，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞大量增殖，實驗結(jié)果表明，3種突變蛋白和野生型SEC2都可劑量依賴性地刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖，且ST-1、ST-2和ST-3的刺激活性與野生型SEC2相比有顯著升高(P＜0.05)，說明SEC2蛋白分子中第102～106位氨基酸的定向替換確實顯著增強了其淋巴細(xì)胞的激活能力。在低劑量下，ST-1的活性優(yōu)于ST-2和ST-3(P＜0.05)；中高劑量下，3種突變蛋白之間的活性無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 SEC2突變蛋白體外抑瘤活性

圖2 SEC2及其突變蛋白體外刺激T 淋巴細(xì)胞增殖活性Fig.2 Assay of murine T-cell proliferation stimulated by wild-type SEC2 and its mutants.

圖3 SEC2及其突變蛋白的抑瘤活性Fig.3 Effects of SEC2 and mutant proteins on the inhibition of tumor cell growth.

超抗原激活T 細(xì)胞后，可在體內(nèi)或體外對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生間接殺傷作用。本研究以小鼠脾淋巴細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，以小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6作為靶細(xì)胞，分析突變蛋白在體外激活T 細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞抑制作用的能力。結(jié)果表明，與陰性對照相比，微量(10 ng/mL)的野生型SEC2及其突變蛋白即可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用。在低劑量下，ST-3的抑瘤能力顯著高于野生型SEC2，而ST-1和ST-2與野生型SEC2無顯著差異(P＞0.05)。在中高劑量下，3種突變蛋白的活性均顯著高于野生型 SEC2(P＜0.05)。其中，ST-2蛋白具有相對最好的抑瘤活性，其在中劑量下其抑瘤活性是野生型SEC2的1.90倍。上述實驗結(jié)果說明ST-1、ST-2和ST-3突變蛋白不僅具有增強了的淋巴細(xì)胞刺激活性，還誘導(dǎo)了增強的腫瘤細(xì)胞生長抑制活性。

2.4 SEC2突變蛋白體內(nèi)致熱活性檢測

SEC2作為一種細(xì)菌外毒素，大劑量時會引發(fā)休克毒性，誘使體溫升高是其毒性表現(xiàn)之一。為了分析SEC2增強型突變體其提高的免疫激活能力，是否伴隨著毒性的增加，本研究以新西蘭大白兔致熱模型對突變體的毒性進行分析。實驗結(jié)果顯示，PBS 陰性對照組試驗動物體溫在整個監(jiān)測時間段內(nèi)均無明顯變化(P＞0.05)。與此相比，給藥組動物體溫均隨監(jiān)測時間延長，呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P＜0.05)，并都出現(xiàn)致熱效應(yīng)。其中，ST-2突變蛋白引起的致熱活性與野生型SEC2相比有顯著提高(P＜0.01)，而ST-1和ST-3突變蛋白的致熱活性與野生型相比無顯著性差異(P＞0.05)。

上述結(jié)果表明，盡管3個突變體的淋巴細(xì)胞刺激活性都顯著高于野生型SEC2，且三者之間無顯著差異，但其致熱毒性的變化卻并不與之一致。ST-2突變蛋白的毒性顯著高于野生型和其他突變蛋白，暗示SEC2的超抗原活性和毒性并不完全關(guān)聯(lián)。

2.5 突變蛋白體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平檢測

為了在細(xì)胞因子水平上解釋突變蛋白超抗原活性增強的機制，本研究以ELISA 方法分別檢測了突變蛋白體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后，IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌水平都顯著高于野生型 SEC2(P＜0.05)，而ST-1、ST-2和ST-3之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖4 SEC2及其突變蛋白體內(nèi)致熱活性Fig.4 Pyrogenicity of wild type SEC2 and the mutants in vivo.

2.6 小鼠TCR mVβ8.2基因的表達(dá)變化

C 型腸毒素可特異性地識別含有小鼠TCR mVβ8.2分子側(cè)鏈的T 細(xì)胞，并激活小鼠mVβ8.2基因的大量轉(zhuǎn)錄和翻譯。為了分析3個突變蛋白對小鼠TCR mVβ8.2分子側(cè)鏈的識別能力，我們以qRT-PCR 技術(shù)對突變蛋白刺激小鼠淋巴細(xì)胞后TCR mVβ8.2基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了分析。結(jié)果顯示，小鼠淋巴細(xì)胞在經(jīng)ST-1、ST-2和ST-3刺激后mVβ8.2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型SEC2。其中，ST-1的刺激效果最明顯，是野生型SEC2的1.57倍。

圖5 小鼠TCR mVβ8.2基因的表達(dá)分析Fig.5 Analysis of murine TCR mVβ8.2 gene expression.

圖6 SEC2和突變蛋白刺激小鼠T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測Fig.6 Test of cytokines secreted by murine T cells stimulated with SEC2 and mutant proteins.(A) IL-2.(B) IFN-γ.(C) TNF-α.

3 討論

金黃色葡萄球菌腸毒素作為一種超級抗原，極微量即可刺激大量T 細(xì)胞增殖并使之產(chǎn)生細(xì)胞因子和細(xì)胞毒作用，提高機體免疫力，從而能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生極強的殺傷作用，故是一種很有應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療藥物[15-16]。

目前，國內(nèi)已經(jīng)將SEC2用于腫瘤的臨床治療，并證明具有一定療效。在治療過程中發(fā)現(xiàn)，盡管SEC2的毒性低，但因其超抗原活性弱于傳統(tǒng)的SEA 和SEB，抗腫瘤效果有待進一步提高[17]。因此，我們希望通過基因工程手段來對SEC2蛋白分子進行改構(gòu)，在保持SEC2低毒性的前提下，獲得超抗原活性高的SEC2突變蛋白作為抗腫瘤候選藥。根據(jù)腸毒素發(fā)揮抗腫瘤作用的機制，我們可以通過提高SEC2與MCHⅡ分子或TCR 的識別和親和能力來增加超抗原活性[11]。但是，提高對MCHⅡ分子的親和性將會增加對MCHⅡ陽性的非腫瘤細(xì)胞的殺傷。因此，對SEC2分子中參與TCR 識別和結(jié)合的功能區(qū)域進行改造以增強超抗原活性是可行的方法。

王小剛等將SEC2中參與形成二硫環(huán)結(jié)構(gòu)的Cys93和Cys110突變?yōu)锳la 或Ser，結(jié)果顯示突變蛋白的超抗原活性有明顯下降，同時對胰蛋白酶的敏感性增強，說明二硫環(huán)結(jié)構(gòu)對于SEC2保持其超抗原活性和穩(wěn)定性起著重要作用[9]。Andersen 等利用噬菌體展示技術(shù)對一系列的SEC3突變蛋白進行篩選，其二硫環(huán)內(nèi)102～106位氨基酸分別被WWP、WWT 和WWH 取代，獲得3種突變蛋白。3種突變蛋白對TCR mVβ8.2的親和性提高了約150倍，且伴隨著T 細(xì)胞的刺激能力明顯增強[11]，證明其TCR 結(jié)合能力強度與T 細(xì)胞刺激能力成正比關(guān)系。而SEC2和SEC3的氨基酸序列高度同源，且二硫環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)氨基酸序列完全相同[18]。因此，我們假設(shè)對SEC2的102～106位氨基進行同樣替換也可以提高TCR的結(jié)合能力，進而提升SEC2的超抗原活性。

研究結(jié)果顯示突變體ST-1、ST-2和ST-3的小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激增殖活性較野生型SEC2顯著增強，暗示SEC2與SEC3可能具有相同的TCR結(jié)合位點，對SEC2的102～106位氨基酸進行相同的替換也可提高SEC2的超抗原活性。3種突變蛋白刺激小鼠TCR mVβ8.2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，進一步證明改造后的氨基酸位點能顯著提高突變蛋白對TCR 的親和能力，驗證了我們前面的假設(shè)。

與超抗原活性的顯著提升相對應(yīng)，3種突變蛋白體外抑制腫瘤生長活性也顯著提高。同時，3種突變蛋白體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α細(xì)胞因子的能力要顯著高于野生型，這也部分解釋了突變蛋白在體外誘導(dǎo)了更強的腫瘤細(xì)胞生長抑制活性的原因[19-21]。ST-1、ST-2和ST-3突變蛋白刺激更多的含有mVβ8.2側(cè)鏈的T 細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的炎癥性細(xì)胞因子的釋放，增強了超抗原的細(xì)胞因子效應(yīng)，進而提高了腫瘤細(xì)胞生長抑制能力。

此外，我們利用動物致熱模型檢測了突變蛋白的休克毒性。研究發(fā)現(xiàn)，盡管三者的超抗原活性都顯著高于野生型SEC2，但只有ST-2突變蛋白引起的致熱活性要顯著高于野生型SEC2；而ST-1和ST-3突變蛋白的致熱活性與野生型無顯著性差異。該結(jié)果再一次說明了由金黃色葡萄球菌腸毒素誘導(dǎo)的超抗原活性和休克毒性之間并不完全關(guān)聯(lián)，兩者在一定程度上是可以分開的[22]。關(guān)于ST-2突變蛋白增強的致熱毒性，我們推測，一方面，ST-2可能誘發(fā)了某些內(nèi)源性致熱細(xì)胞因子的增強表達(dá)，進而直接或間接刺激神經(jīng)致熱中樞產(chǎn)生致熱效應(yīng)，致使動物體溫升高[23]；另一方面，ST-2蛋白的WWT 氨基酸的替換可能引起 SEC2分子構(gòu)象的強烈改變，使MCHⅡ結(jié)合位點暴露，增強了抗原提呈作用，致使試驗動物體內(nèi)免疫排斥增強，最終表現(xiàn)出致熱活性升高的體征。

本研究通過基因工程手段構(gòu)建了3種SEC2突變體ST-1、ST-2和ST-3，3種突變體顯示出增強的超抗原活性，其體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和促進小鼠TCR mVβ8.2基因轉(zhuǎn)錄的水平顯著高于野生型SEC2，說明二硫環(huán)內(nèi)部氨基酸殘基對SEC2的超抗原活性具有重要作用，也暗示改造后的突變蛋白對小鼠TCR 親和力的提高。另外，SEC2突變蛋白的超抗原活性與致熱毒性的強弱并不完全關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果為我們在實際應(yīng)用中開發(fā)和篩選低毒高效的腸毒素超抗原抗腫瘤候選藥物奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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