金迪,秦艷杰,閆喜武,李霞,趙力強

(大連海洋大學水產與生命學院遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心,遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔SRAP標記體系的建立及不同殼色品系的遺傳學分析

金迪,秦艷杰,閆喜武,李霞,趙力強

(大連海洋大學水產與生命學院遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心,遼寧大連116023)

首次建立并優(yōu)化了菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum SRAP分子標記技術體系,并利用17對引物組合對經過連續(xù)選育的白蛤、橙蛤和墨蛤3個菲律賓蛤仔品系進行了分子標記分析。結果表明:3個品系蛤仔共擴增出510個位點,白蛤品系的Nei指數和Shannon指數均顯著高于墨蛤和橙蛤品系 (P＜0.05);遺傳分化指數 (Gst)為0.000 1～0.644 8,平均為0.046 7,表明有4.67%的變異存在于群體間,95.33%的變異存在于群體內;基因流 (Nm)為0.275 4～2 000,平均每個位點的Nm為10.202 7;白蛤和墨蛤品系間的遺傳距離最近 (0.028 2),白蛤和橙蛤品系間的遺傳距離最遠(0.039 6)。研究結果表明,白蛤、橙蛤和墨蛤3個蛤仔品系間有很強的基因交流,遺傳分化程度較弱,提示蛤仔品種的人工選育工作需持續(xù)進行。

菲律賓蛤仔;SRAP;品系;遺傳學

蛤仔是中國四大養(yǎng)殖貝類之一,目前年產量約300萬t,占世界貝類總產量的90%,占中國海水養(yǎng)殖總產量的20%,占灘涂貝類總產量的73%[1]。國內外對菲律賓蛤仔的研究有較多報道,主要涉及養(yǎng)殖和人工繁育[1-2]、生理生態(tài)學[3-5]、凝集素的分離[6]等方面。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,蛤仔傳統(tǒng)育種學的工作已經大規(guī)模展開[7-8],但涉及分子標記及輔助育種方面內容較少,目前僅見利用RAPD[9]、AFLP[10]和微衛(wèi)星[11-14]標記進行群體遺傳學的研究報道。育種工作相對滯后,已成為蛤仔養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

SRAP由美國加州大學蔬菜作物系Li等[15]于2001年提出,又稱基于序列擴增多態(tài)性 (Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)。該標記利用其獨特的引物設計原則對開放讀碼框(ORFs)進行擴增,其具有簡便、穩(wěn)定、產率高、成本低、使用廣泛和便于克隆目標片段的優(yōu)點,已廣泛應用于多種作物的遺傳多樣性研究和圖譜構建[16-17]。SRAP標記用于水產動物研究的報道僅見少數甲殼動物[18-19]、 部分魚類[20-21]、 扇貝[22]、 皺紋盤鮑[23]等。本研究中,以連續(xù)多年選育所得的3個菲律賓蛤仔品系為研究對象,首次建立并優(yōu)化了蛤仔SRAP分子標記體系,并在此基礎上開展了3個蛤仔品系SRAP分子標記的研究,期待對不同蛤仔品系的遺傳多樣性及遺傳分化狀況加以評價,并通過篩選各品系間差異顯著的SRAP標記位點,揭示各蛤仔品系優(yōu)良性狀的遺傳機理,為蛤仔分子遺傳學和分子標記輔助育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗蛤仔取自莊河海洋貝類育苗場,經連續(xù)多代選育出的白、墨、橙3種不同殼色的蛤仔品系(選育代數分別為6、6、5代)(圖1),各取30個個體,殼長分別為(2.03±0.54)、(1.89±0.46)、(2.15±0.67)cm,在取樣地點將新鮮樣品運回實驗室,取其閉殼肌、外套膜等組織分別用體積分數為75%的乙醇固定,于冰箱 (4℃)中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 采用常規(guī)酚-氯仿法提取蛤仔基因組DNA,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳 (含1.5 μL EB)檢測模板質量。

圖1 3種蛤仔品系個體Fig.1 Individuals in the three clam strains

1.2.2 引物序列的確定 按照已經公布的SRAP通用引物序列,篩選Me和Em引物各6條,引物序列如表1,上下游交叉共得到36對引物組合。

表1 SRAP引物序列Tab.1 Sequences of the SRAP primers

1.2.3 SRAP-PCR擴增體系的優(yōu)化及產物的檢測

PCR擴增采用25 μL反應體系,分別對模板(1.0、2.0 μL),10 μmol/L引物 (1.0、1.5 μL), 2.5 mmol/L dNTP(2.0、3.0 μL),25 mmol/L Mg2+(1.0、1.5、2.0 μL),5 U/μL Taq酶 (0.2、0.35、0.5 μL)設置不同用量并進行體系優(yōu)化。

PCR擴增程序:94℃下預變性5 min;94℃下變性1 min,35℃下退火1 min,72℃下延伸1 min,共進行5個循環(huán);之后在94℃下變性1 min, 50℃下退火1 min,72℃下延伸1 min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min,并于4℃下保存。產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,確定帶型清晰、穩(wěn)定、雜帶少的25 μL PCR反應體系為:DNA模板2.0 μL,10 μmol/L引物1.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL,25 mmol/L Mg2+1.0 μL,5 U/μL Taq酶0.2 μL,ddH2O 13.5 μL。

利用上述PCR反應體系和反應程序,對36對引物組合進行篩選,選擇帶型清晰、穩(wěn)定、雜帶少的17對引物組合 E1/M1、E1/M3、E1/M4、E1/ M5、E1/M6、E2/M1、E3/M3、E3/M4、E3/M5、E3/M6、E4/M1、E4/M2、E4/M4、E5/M4、E5/ M6、E6/M3、E6/M5,用于3個不同殼色蛤仔品系的遺傳學分析。

1.2.4 SRAP譜帶統(tǒng)計分析及遺傳學指標的計算

根據分子量標準,對照反應產物在凝膠上的相應位置,估計擴增產物的分子量大小,以 “引物名 + f+分子量大小”方式對各個位點命名。

按照顯性標記進行帶型統(tǒng)計,有帶視為顯性基因型 (包括顯性純合和顯性雜合),無帶視為隱性純合基因型。有帶且清晰的帶型記為 “1”,無帶的帶型記為 “0”,不清晰的帶型記為 “.”,統(tǒng)計形成0/1矩陣。多態(tài)位點比例、Nei指數和Shannon指數等遺傳多樣性指標以及遺傳相似度、遺傳距離等遺傳分化指標均由PopGene 32軟件計算得出。應用Mega 3.1軟件對所有個體進行遺傳關系聚類圖的構建。使用SPSS 11.5軟件對試驗數據進行單因素方差分析和檢驗。

2 結果

2.1 SRAP擴增帶型

17對引物組合在3個蛤仔品系中進行PCR擴增,擴增片段長度為50～1 310 bp。其中E1/M6和E1/M5引物在部分蛤仔個體中的擴增結果見圖2。所有引物共產生了510個清晰的標記 (多態(tài)位點比例為100%),每對引物產生的標記為20～38個,平均每對引物產生30個標記。其中13對引物產生的位點在 3個品系中的多態(tài)性比例均為100%。

17對引物在白蛤、墨蛤和橙蛤品系中分別擴增出508、505和504個位點,多態(tài)性比例分別為100%、99.41%和99.80%。3個品系的多態(tài)性位點比例無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 3個蛤仔品系的遺傳多樣性及遺傳分化

圖2 引物E1/M6和E1/M5在3個品系部分蛤仔中的擴增結果Fig.2 SRAP fingerprinting of some individuals in three strains of clams by primers E1/M6 and E1/M5

17對引物的擴增片段統(tǒng)計成0/1矩陣,經計算得到平均Shannon指數、Nei指數見表2。方差分析結果表明,這兩個指標在3個品系之間存在顯著差異 (P＜0.05)。多重比較結果表明,白蛤品系的兩個遺傳多樣性指標均顯著高于墨蛤和橙蛤品系(P＜0.05),而墨蛤和橙蛤品系之間無顯著性差異(P＞0.05)?；笖?(Gst)為0.000 1(E3/M4f399) ～0.644 8 (E1/M5f84),平均為0.046 7,說明有4.67%的變異存在于群體間,95.33%的變異存在于群體內,不同位點的Nm為0.275 4(E1/M5f84) ～2 000 (E3/M4f399),平均每個位點的Nm為10.202 7。

白蛤和墨蛤品系間的遺傳距離最近(0.028 2),遺傳相似度為0.972 2;白蛤和橙蛤品系間的遺傳距離最遠 (0.039 6),遺傳相似度為0.961 1。白蛤、墨蛤和橙蛤群體內的平均遺傳距離分別為0.591 2、0.527 5和0.513 1,群體內的遺傳相似度分別為0.556 3、0.591 3和0.599 8。3個品系共90個個體群體內的遺傳距離為0.553 0,群體內的遺傳相似度為0.576 6。從3個品系90個個體的遺傳聚類圖 (圖3)可以看出,絕大多數同種顏色的蛤仔聚在一起。

表2 3種殼色蛤仔品系遺傳多樣性分析Tab.2 The genetic diversity of three clam strains with 3 shell colors

圖3 3個品系90個蛤仔的遺傳聚類圖 (NJ法)Fig.3 Clustal analysis among individuals of clams in three strains(NJ method)

3個品系總的Nei指數為0.334 4±0.120 1,總的Shannon指數為0.508 1±0.143 5。群體總的遺傳多樣度 (Ht)為0.334 3±0.014 4,群體內的遺傳多樣度 (Hs)為0.318 7±0.012 9,群體間的遺傳多樣度 (Ht-Hs)為0.015 6。不同位點的遺傳分

2.3 3個蛤仔品系間出現頻率差異的SRAP位點分析

用SPSS 11.5軟件的R×C檢驗法進行檢驗,在17對SRAP標記獲得的510個位點中,3個品系間呈現顯著頻率差異的位點為147個 (P＜0.05),占所有位點的28.82%;呈現極顯著頻率差異的位點為82個 (P＜0.01),占16.08%。引物E1/M5和E6/M5多態(tài)位點檢出率較高 (＞40%)(表3)。

表3 不同蛤仔品系間出現頻率差異的SRAP位點數及比例Tab.3 The number and percent of SRAP loci showing significant differences in frequency among the three clam strains

其中白蛤中出現頻率顯著高于墨蛤和橙蛤(后二者差異不顯著)的位點為30個,顯著低于墨蛤和橙蛤 (后二者差異不顯著)的位點9個;橙蛤中出現頻率顯著高于白蛤和墨蛤 (后二者差異不顯著)的位點24個,顯著低于白蛤和墨蛤(后二者差異不顯著)的位點16個;墨蛤中出現頻率顯著高于和低于白蛤和橙蛤 (后二者差異不顯著)的位點均為18個;在3個品系兩兩間均存在顯著差異的位點8個,而3個品系中僅在兩個品系間存在顯著差異的位點24個。

3 討論

3.1 蛤仔SRAP標記與群體遺傳學

利用分子標記對菲律賓蛤仔進行分子遺傳學的研究報道主要集中在RAPD、AFLP和SSR等標記手段方面,如裴贏等[9]用RAPD方法,對大連渤海沿海6個菲律賓蛤仔群體進行研究,結果表明,多態(tài)位點比例為58.65% ～71.15%,Nei指數為0.159 9～0.197 3。劉相全等[10]對青島菲律賓蛤仔群體 (18個個體)進行了AFLP標記研究,發(fā)現4對AFLP引物在蛤仔群體中共得到216個位點,多態(tài)性比例為87.9%,群體內遺傳相似度為0.605 1, Shannon指數為0.252 6。閆喜武等[11]利用13個微衛(wèi)星座位在大連、莆田和青島的蛤仔群體中共檢測到154個等位基因,平均觀測雜合度為0.238 3～0.438 7,3個蛤仔群體內的遺傳距離分別為0.517 8、0.659 2和0.548 0,遺傳相似度分別為0.693 0、0.542 6和0.598 6,3個群體間的遺傳距離為0.110 8～0.432 3,遺傳相似度為0.649 0～0.895 2。虞志飛等[12]利用12對微衛(wèi)星引物對大連菲律賓蛤仔群體連續(xù)4個選育世代進行了遺傳多樣性分析,4個世代的平均觀測雜合度分別為0.378 6、0.339 1、0.386 0和0.357 4。

本研究中17對SRAP引物在3個連續(xù)選育形成的蛤仔品系中共產生了510個清晰的標記,多態(tài)性比例為98.43% ～99.41%,標記效率較RAPD、SSR標記要高,且多態(tài)性位點檢出率也顯著高于AFLP、RAPD和SSR標記。這是因為雖然外顯序列在不同的物種間是保守的,多態(tài)性水平較低,但啟動子、內含子及其間隔序列在物種間甚至個體間都有很大的差異,有很高的多態(tài)性[24]。因此認為,采用SRAP標記法研究種內與種間的多樣性時非常有效,尤其適用于品種間的分析[25]。另外,3個蛤仔品系群體Shannon指數為0.476 2～0.504 1, Nei指數為0.311 7～0.332 3,這兩個遺傳學指標較裴贏等[9]、劉相全等[10]所報道的結果要高,這可能是因研究對象群體地理位置差異、檢測手段的差異造成的。而本研究結果中的遺傳多樣性指標、遺傳距離及遺傳相似度指標均與閆喜武等[11]、虞志飛等[12]利用共顯性標記 (微衛(wèi)星)研究所得的結果相近。眾所周知,微衛(wèi)星標記作為共顯性標記,對遺傳多樣性及遺傳分化指標的計算較穩(wěn)定準確,而本研究中采用SRAP標記所得結果與共顯性標記所得結果相近,說明SRAP標記可以作為蛤仔群體遺傳學研究的分子標記手段。

另外,對基因組開放閱讀框擴增,提高了擴增結果與表現型的相關性,能更多地反映材料的表型差異[16]。目前,利用SRAP標記進行基因定位并篩選標記、基因的研究較多[17,26],但在水產動物中的應用較少,僅見呂耀平等[21]對甌江彩鯉體色相關的SRAP標記進行了篩選,并進行了SCAR標記分析?；诠P者對蛤仔的前期研究結果,發(fā)現蛤仔具有差異明顯的貝殼顏色,并在生長、抗逆性方面均存在差異,因此,根據不同的育種目標,定向培育出了白蛤、橙蛤和墨蛤3個蛤仔品系。通過SRAP標記研究發(fā)現,3個品系蛤仔群體間呈現顯著頻率差異的位點147個,呈現極顯著頻率差異的位點82個。這些標記的獲得,加之SRAP標記擴增位點的特殊性,將為揭示蛤仔殼色、生長和抗逆性的遺傳機理奠定基礎。

3.2 3個蛤仔品系的遺傳分化

群體間遺傳相似度與遺傳距離能反映群體間的親緣關系。Thrope[27]認為,同科屬間遺傳距離(D)為0.5～0.9,同屬種間D為0.2～0.8,同種種群間D為0.03～0.2。本研究中發(fā)現,3個蛤仔品系間的遺傳距離為0.028 2～0.039 6,遺傳相似度為0.972 2～0.961 1,由此可見,3個蛤仔品系屬于同種不同種群的位置。

Wright等[28]對遺傳分化指數作了界定:Gst為(0～0.05]時,群體遺傳分化較弱;Gst為(0.05～0.15]時,群體遺傳分化中等;Gst為(0.15～0.25]時,群體遺傳分化較大;Gst＞0.25時,表示分化極大。本研究中計算得出不同位點的Gst為0.000 1～0.644 8,平均為0.046 7,說明有4.67%的變異存在于群體間,95.33%的變異存在于群體內。另外,本研究中不同位點的 Nm為0.275 4～2 000,平均每個位點的Nm為10.202 7?；蛄髦饕侵富蛟谌后w之內和群體之間的流動,當Nm＞1時,說明種群間有很強的基因交流,足以抵制由于選擇等行為導致的遺傳漂變的作用[29]。所有結果均表明,3個蛤仔品系沒有明顯的遺傳分化,這與其遺傳相似性指數的結果較高(0.961 1～0.972 2)相符合。有報道表明,海洋貝類往往雜合度較高[30],這也預示著對貝類的育種及品種培育工作歷程勢必較長,因此,對菲律賓蛤仔各品系的人工選育還需要持續(xù)下去。

[1] 閆喜武.菲律賓蛤仔養(yǎng)殖生物學、養(yǎng)殖技術與品種選育[D].青島:中國科學院研究生院(海洋研究所),2005.

[2] 梁俊,閆喜武,李霞,等.菲律賓蛤仔性腺發(fā)育生物學零度的研究[J].海洋科學,2007,31(9):67-72.

[3] 蔣紅,崔毅,陳碧娟,等.乳山灣菲律賓蛤仔可溶性氮、磷排泄及其與溫度的關系[J].中國水產科學,2006,13(2):237-242.

[4] 董波,薛欽昭,李軍.環(huán)境因子對菲律賓蛤仔攝食生理生態(tài)的影響[J].海洋與湖沼,2000,31(6):636-641.

[5] 丁鑒鋒,楊霏,閆喜武,等.不同殼色菲律賓蛤仔免疫機能的比較研究[J].大連海洋大學學報,2012,27(5):411-416.

[6] 李偉,陳文,佟長青,等.菲律賓蛤仔凝集素的分離純化及抑菌活性研究[J].大連海洋大學學報,2012,27(4):333-337.

[7] 閆喜武,張躍環(huán),霍忠明,等.不同殼色菲律賓蛤仔品系間的雙列雜交[J].水產學報,2008,32(6):864-875.

[8] 閆喜武,張躍環(huán),孫煥強,等.菲律賓蛤仔兩道紅與白斑馬品系的三元雜交[J].水產學報,2010,34(8):1190-1197.

[9] 裴贏,王曉紅,張恒慶.大連渤海沿海菲律賓蛤仔種群的RAPD分析[J].水產科學,2006,25(5):250-252.

[10] 劉相全,包振民,胡景杰,等.兩種蛤仔群體遺傳多樣性的形態(tài)參數及AFLP分析[J].海洋與湖沼,2010,41(3):359-364.

[11] 閆喜武,虞志飛,秦艷杰,等.菲律賓蛤仔EST-SSRs標記開發(fā)及不同地理群體遺傳多樣性[J].生態(tài)學報,2011,31(15): 4190-4198.

[12] 虞志飛,閆喜武,楊霏,等.菲律賓蛤仔大連群體不同世代的遺傳多樣性[J].生態(tài)學報,2011,31(15):4199-4206.

[13] Mura L,Cossu P,Lai T,et al.Survey of the genetic variability of populations of Ruditapes philippinarum from the Gulf of Olbia(NE Sardinia)by mocrosatellites[J].Biol Mar Mediterr,2011,18 (1):266-267.

[14] An H S,Park K J,Cho K C,et al.Genetic structure of Korean population of clam Ruditapes philippinarum inferred from microsatellite marker analysis[J].Biochemical Systematics and Ecology, 2012,44:186-195.

[15] Li G,Quiros C F.Sequenced related amplified polymorphism (SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theoreticale and Applied Genetics,2001,103(3):455-461.

[16] 趙雪,謝華,馬榮才.植物功能基因組研究中出現的新型分子標記[J].中國生物工程雜志,2007,27(8):104-110.

[17] 鄧思立,潘俊松,何歡樂,等.黃瓜M基因連鎖圖譜的SRAP分子標記[J].上海交通大學學報:農業(yè)科學版,2006,24(3):240-244.

[18] 周勁松,曹哲明,楊國梁,等.羅氏沼蝦緬甸引進種和浙江本地種及其雜交種的生長性能與SRAP分析[J].中國水產科學,2006,13(4):667-673.

[19] 陳華增,李健,王清印,等.“黃海1號”中國明對蝦抗逆性狀SRAP標記[J].中國水產科學,2011,18(6):1243-1249.

[20] 張志偉,韓曜平,仲霞銘,等.草魚野生群體和人工繁殖群體遺傳結構的比較研究[J].中國水產科學,2007,14(5):720-725.

[21] 呂耀平,胡則輝,王成輝,等.與“全紅”甌江彩鯉體色相關的SRAP及SCAR分子標記[J].水生生物學報,2011,35(1):45-50.

[22] 程寧寧,楊愛國,劉志鴻,等.櫛孔扇貝(♀)×蝦夷扇貝(♂)子一代雜種優(yōu)勢的SRAP分析[J].海洋科學,2009,33(10): 107-111.

[23] 劉明泰,李楊,劉小林,等.皺紋盤鮑SRAP反應體系的正交優(yōu)化[J].大連海洋大學學報,2013,28(1):12-16.

[24] Ding W D,Cao Z M,Cao L P.Molecular analysis of grass carp Ctenopharyngodon idella by SRAP and SCAR molecular markers [J].Aquaculture International,2010,18:575-587.

[25] 譚祖猛,李云昌,胡瓊,等.通過分子標記估算遺傳距離預測甘藍型油菜的雜種優(yōu)勢[J].中國油料作物學報,2007,29(2): 126-132.

[26] Liu Y Q,Wu W R.Identification of salt-responsive genes in English cordgrass Spartina anglica roots using SRAP technique[J]. Journal of Zhejiang University(Agriculture and Life Sciences), 2006,32(5):511-514.

[27] Thrope J P.The molecular clock hypothesis:biochemical evolution,genetic differentiation and systematics[J].Ann Rev Evol Syst,1982,13(2):139-168.

[28] Wright J M,Bentzen P.Microsatellites:genetic markers for the future[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries,1994,4(3): 384-388.

[29] 張婧,常亞青,丁君,等.蝦夷扇貝不同殼色間的遺傳結構及微衛(wèi)星標記與生長性狀相關分析[J].中國農學通報,2011,27 (26):83-91.

[30] Saavedra C,Bachère E.Bivalve genenomic[J].Aquaculture, 2006,256:1-14.

Establishment of SRAP reaction conditions and the genetic analysis of three strains with different shell colors in Manila clam Ruditapes philippinarum

JIN Di,QIN Yan-jie,YAN Xi-wu,LI Xia,ZHAO Li-qiang
(Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province,College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

A SRAP-PCR system was established and the genetic diversity were analyzed in Manila clam Ruditapes philippinarum with white(W),black(B)and orange(O)shell colors through selective breeding by 17 pairs of SRAP primers screened from 36 primer combinations.A total of 510 loci were detected with 17 primer pairs,and Shannon's information index and Nei's gene diversity were found significant higher in W strain than those in B and O strain(P＜0.05),without significant differences between the last two strains.F-statistics(Gst)were varied from 0.000 1 to 0.644 8,with the mean value of 0.046 7,indicating that 4.67%of variations were observed between B and O strains,and 95.33%of variations within the populations.The gene flow were found between 0.275 4 and 2 000,with mean 10.202 7,and genetic distances between 0.028 2(W and B)and 0.039 6(W and O).The findings showed that there were weak genetic differentiations and strong gene flow among the three clam strains,and that the selective breeding for the clam was continued in order to establish new breeding.The 147 SRAP loci showing significant differences in frequency among the three strains(P＜0.05),and the 82 SRAP loci showing very significant differences in frequency among the three strains(P＜0.01),providing the foundation for explanation of the genetic basis of the good traits such as good growth,strong resistance and special shell colors in the three strains.

Ruditapes philippinarum;SRAP;strain;genetics

Q959.215

:A

2095-1388(2013)04-0361-06

2012-10-29

國家 “863”計劃項目 (2012AA10A410-2);現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項 (CARS-48)

金迪 (1986-),女,碩士研究生。E-mail:youyad@yahoo.cn

秦艷杰 (1977-),女,博士,副教授。E-mail:qinyanjie@dlou.edu.cn