黃思明， 尹平河， 趙 玲

(暨南大學(xué)1.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)系;2.理工學(xué)院 環(huán)境工程系，廣東 廣州 510632)

球形棕囊藻是我國東南沿海典型高發(fā)的赤潮藻種之一，近幾年來發(fā)生頻率不斷上升，受災(zāi)面積不斷擴(kuò)大，帶來的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境損失不可估量［1-4］.球形棕囊藻大量繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生巨大數(shù)目的膠質(zhì)、糖和溶血毒素，同時(shí)消耗大量溶解氧，造成魚類大面積死亡;其釋放的二甲基丙磺酸和二甲基硫醚對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生較大的影響［3-9］.因而選擇一種有效的治理球形棕囊藻赤潮的方法勢在必行.

根據(jù)國際上對(duì)赤潮防治劑“高效、低毒、價(jià)廉、易得”的要求，赤潮治理在采用物理和化學(xué)防治方法不甚理想的情況下，人們?cè)絹碓蕉嗟匕涯抗馔断蛄松锓椒?，其中生物方法中的?xì)菌防治赤潮既可去除赤潮藻細(xì)胞，使得海洋環(huán)境保持長期可靠的生態(tài)平衡，又可以避免赤潮毒素可能在其他生物體中富集的缺陷，已成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的趨勢［10-15］.目前，在淡水領(lǐng)域藻菌關(guān)系的研究比較深入［16-18］，但對(duì)海水中的藻菌關(guān)系和溶藻細(xì)菌治理赤潮的研究工作相對(duì)較少，尤其對(duì)赤潮藻中球形棕囊藻的報(bào)道較為鮮見.因此開展溶藻細(xì)菌治理球形棕囊藻的研究具有重要的科學(xué)價(jià)值.環(huán)境因子是重要生態(tài)平衡因素，目前的研究大多是探討對(duì)藻生長的影響以及對(duì)溶藻細(xì)菌生長的影響，而環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌溶藻過程中影響的報(bào)道相對(duì)較少.

本研究考察了海水介質(zhì)中芽孢桿菌B1對(duì)球形棕囊藻生長的影響，研究了環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌溶藻效果的影響，以期探索出細(xì)菌在抑制藻類生長時(shí)的環(huán)境影響規(guī)律，為赤潮的微生物防治提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藻種

供試藻種為球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)，來源于暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心藻種室.藻類培養(yǎng)液選用 F/2改良配方(Guillard)［19］，培養(yǎng)溫度(20±1)℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h.

1.2 溶藻細(xì)菌

從珠海香洲碼頭赤潮發(fā)生海水中采集水樣，經(jīng)過分離、純化和篩選得到溶藻細(xì)菌B1，經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為1 542 bp，序列在GenBank中的菌株編號(hào)為 Bankit 1465471，登錄號(hào)為JN228893.菌種以 2216E 斜面培養(yǎng)基［20］4 ℃ 冷藏保存.

1.3 球形棕囊藻干質(zhì)量測定實(shí)驗(yàn)

將20 mL的藻液加入烘干至恒重的離心管中，3 000 r/min離心30 min，倒去上清，敞口放置于60℃干燥箱中烘干至恒重，放于干燥器中冷卻30 min，準(zhǔn)確稱量，離心管增量就是球形棕囊藻的干質(zhì)量，平行3次，取平均值.

1.4 色素和葉綠素a色譜分析方法［3，20］

色素提取:取球形棕囊藻藻液20 mL，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，棄上清液，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%丙酮，放置在4℃的冰箱中靜置24 h，以4 000 r/min離心15 min，上清液用分光光度法測定葉綠素a含量，亦可用高效液相色譜進(jìn)行色素分析.

色譜條件:流動(dòng)相 A(V甲醇∶V0.5mol/L醋酸銨=80∶20，pH 7.2)流動(dòng)相 B(V乙睛∶V水=90∶10)，流動(dòng)相 C(V乙酸乙醋);梯度洗脫條件:0～5 min，流動(dòng)相 A 線性梯度變化到流動(dòng)相B;5～10 min，流動(dòng)相B:20%，流動(dòng)相C增加到80%;10～15 min，流動(dòng)相B梯度上升到100%;18～25 min，流動(dòng)相B按線性梯度變化過渡到流動(dòng)相A，保持100%流動(dòng)相A的濃度到洗脫完畢.流速為 0.8 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL，檢測波長為436 nm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%丙酮溶液做空白，測定巖藻黃素、硅甲藻黃素、葉綠素a、別藻黃素和葉黃素5種色素.

1.5 溶藻實(shí)驗(yàn)

分別在100 mL藻液中加入一定量不同生長期的菌液，測定球形棕囊藻細(xì)胞密度，計(jì)算細(xì)菌對(duì)藻細(xì)胞生長的影響.設(shè)空白對(duì)照，3份平行實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣測定藻細(xì)胞密度，判斷細(xì)菌溶藻效果.

1.6 不同環(huán)境因子下的溶藻實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取不同藻密度、溫度、光照、鹽度、藻培養(yǎng)基中N和P含量等環(huán)境因子，探討不同環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌溶藻效果的影響.藻密度分別選擇處于調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期的藻液;控制溫度為:15、20、25、30℃;根據(jù)光照時(shí)間并將其延伸至極端條件，選擇光暗比分別為:24 h/0 h、15 h/9 h、12 h/12 h、9 h/1 h、0 h/24 h;棕囊藻為鹽度適應(yīng)范圍非常廣的藻類，選擇鹽度為:20‰、25‰、30‰、35‰、40‰、45‰;藻培養(yǎng)基中N和P的含量分別用硝酸鈉和磷酸二氫鈉表示:硝酸鈉加倍(++)、硝酸鈉減半(-)、磷酸二氫鈉加倍(++)、磷酸二氫鈉減半(-).實(shí)驗(yàn)中，在100 mL藻液中加入1.0 mL處于穩(wěn)定期的菌液，設(shè)空白對(duì)照，3份平行實(shí)驗(yàn)，定時(shí)通分光光度法測定葉綠素a含量，判斷環(huán)境因子對(duì)菌液溶藻效果的影響.

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行樣品顯著性分析，P＞0.05表明差異不顯著，P＜0.05表明差異顯著，P＜0.01表明差異極顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生長期細(xì)菌對(duì)球形棕囊藻溶藻的影響

研究表明，細(xì)菌B1在2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0～6 h為生長調(diào)整期，10～24 h為對(duì)數(shù)期，24 h之后為穩(wěn)定期，選取t=4、14、32 h時(shí)的細(xì)菌 B1分別檢測其溶藻能力，結(jié)果見圖1.從圖1中可以看出，與對(duì)照組相比，調(diào)整期(t檢驗(yàn)，P＞0.05)溶藻效果不顯著，藻細(xì)胞密度與對(duì)照組相近，藻去除率為22.6%;對(duì)數(shù)期(t檢驗(yàn)，P ＜0.05)溶藻效果顯著，藻去除率為72.1%;穩(wěn)定期(t檢驗(yàn)，P ＜0.01)溶藻效果極顯著，藻去除率達(dá)到93.9%.實(shí)驗(yàn)表明采用穩(wěn)定期的B1菌株溶藻能力最強(qiáng)，在控制赤潮的實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)采用處于穩(wěn)定期菌液的控藻策略，以獲得更好的溶藻效果.

圖1 不同生長期細(xì)菌B1對(duì)藻細(xì)胞數(shù)的影響Fig.1 The effects of bacteria B1 in different growth periods on algal cell number

不同生長時(shí)期的細(xì)菌B1對(duì)球形棕囊藻干重影響試驗(yàn)見圖2，圖1和圖2對(duì)比可見，與藻細(xì)胞密度變化表現(xiàn)出相同的趨勢，隨著藻細(xì)胞密度減少，藻干重也隨著減小.實(shí)驗(yàn)第6 d，與對(duì)照組相比較，調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以干質(zhì)量表示的去除率分別為:31.8%、76.1%、94.7%.與測量藻細(xì)胞密度得出的結(jié)論相近.

2.2 菌液添加量對(duì)球形棕囊藻生長的影響

在 100 mL 藻液中分別加入 0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL B1 菌液，并通過稀釋平板計(jì)數(shù)法得到細(xì)菌數(shù)，檢測溶藻效果，結(jié)果見圖3.由圖3可見，空白對(duì)照組藻細(xì)胞密度呈持續(xù)增長，與之相比，加入菌液后，藻細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，當(dāng)加入菌液為0.1、0.5 mL(t檢驗(yàn)，P ＞0.05)時(shí)，抑制作用不明顯，直至實(shí)驗(yàn)第4天，藻細(xì)胞密度呈上升趨勢，與對(duì)照組相近，溶藻效果不顯著.當(dāng)加入B1菌液為1.0、3.0、5.0、7.0 mL(t檢驗(yàn)，P ＜0.01)，藻細(xì)胞密度從第1天起呈明顯的下降趨勢，溶藻第4天去除率分別達(dá) 92.7%、94.8%、95.1%、95.2%，表現(xiàn)出極顯著的溶藻效果.由此說明B1溶藻效果明顯，并且有一定的作用飽和度，在100 mL藻液中加入1.0 mL菌液溶藻效果最好，最佳添加體積比為1%.

圖2 不同生長期細(xì)菌B1對(duì)藻干質(zhì)量的影響Fig.2 The effects of bacteria B1 in different growth periods on algal dry weight

圖3 B1菌液添加量對(duì)球形棕囊藻生長的影響Fig.3 The lytic effect of addition volumes of bacteria B1 on Phaeocystis globosa

2.3 藻密度對(duì)溶藻效果的影響

圖4為細(xì)菌B1對(duì)不同密度的球形棕囊藻去除率變化.藻密度選擇了處于調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期的球形棕囊藻藻液，實(shí)驗(yàn)第4天，處于調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期球形棕囊藻的去除率分別為97.8%、88.6%、72.8%.這可能是由于處于穩(wěn)定期的球形棕囊藻，相對(duì)于調(diào)整期和對(duì)數(shù)期而言，藻密度高，藻的分泌物增加，對(duì)藻起到一定的保護(hù)作用，從而使細(xì)菌對(duì)穩(wěn)定期球形棕囊藻的去除率低于調(diào)整期和對(duì)數(shù)生長期;調(diào)整期藻的去除率高于對(duì)數(shù)期藻的去除率，可能是由于處于對(duì)數(shù)期的藻生物量快速增加，藻密度處于上升趨勢，彌補(bǔ)了部分細(xì)菌去除的藻，從而導(dǎo)致在一定的時(shí)間內(nèi)，對(duì)數(shù)期藻的去除率低于調(diào)整期.由此表明，在利用細(xì)菌B1治理球形棕囊藻時(shí)，應(yīng)該選擇在藻類密度低的調(diào)整期進(jìn)行治理，效果更為顯著.這與晉利等［21］的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)一株芽孢桿菌對(duì)處于調(diào)整期的銅綠微囊藻的溶藻效果最好.

圖4 B1菌液對(duì)不同生長階段的棕囊藻溶藻效果Fig.4 The lytic effect of bacteria B1on the different growthphase of Phaeocystis globosa

2.4 溫度對(duì)溶藻效果的影響

圖5為溫度對(duì)細(xì)菌溶藻效果的影響.如圖5所示，溫度對(duì)細(xì)菌B1的溶藻效果有一定的影響，分別對(duì)比不同溫度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a含量，在30℃時(shí)(t檢驗(yàn)，P＜0.01)，溶藻效果極顯著，藻去除率達(dá)到96.1%，在15、20、25 ℃時(shí)(t檢驗(yàn)，P ＜0.05)，溶藻效果表現(xiàn)為顯著，藻去除率分別為75.6%、68.1%、78.3%.可能原因是:不同溫度下藻的生長狀況不同，在溫度為15、20、25℃時(shí)，球形棕囊藻具有良好的生長狀態(tài)，抵御外來侵?jǐn)_的能力較強(qiáng)，在溶藻細(xì)菌作用下，藻細(xì)胞數(shù)目也不會(huì)有太大的減少，使得溶藻效果相對(duì)較弱.在溫度30℃時(shí)不利于藻細(xì)胞生長，藻細(xì)胞的生長狀況差，細(xì)菌保持著相對(duì)較高的繁殖率，使得溶藻效果增強(qiáng).

溫度對(duì)色素影響的HPLC分析結(jié)果見表1.從表1可見，5種色素巖藻黃素、硅甲藻黃素、葉綠素a、別藻黃素和葉黃素中葉綠素a含量最高.溫度對(duì)5種色素均產(chǎn)生影響，30℃時(shí)，色素信號(hào)值最低.在15、20、25、30℃條件下細(xì)菌B1對(duì)葉綠素a的去除率分別為:79.1%、69.5%、78.2%、95.2%.所得藻去除率與丙酮法測葉綠素a含量得出的去除率相近.

圖5 不同溫度條件對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響Fig.5 The lytic effect of bacteria B1on Phaeocystis globosa at different temperature

表1 不同溫度條件下溶藻實(shí)驗(yàn)中藻細(xì)胞色素HPLC分析Table1 HPLC traces of pigments of Phaeocystis globosa under different temperature in dissolved algal process

2.5 光照對(duì)溶藻效果的影響

光照時(shí)間對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響見圖6.由圖6可知，在光暗比為24 h/0 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組葉綠素a含量相近(t檢驗(yàn)，P＞0.05)，細(xì)菌的溶藻效果不顯著，藻去除率為38.1%.在光暗比分別為15 h/9 h、12 h/12 h和9 h/15 h時(shí)，細(xì)菌的溶藻效果顯著，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量相差較大(t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05)，藻去除率分別為 82.4%、84.8%、86.4%.在黑暗條件(0 h/24 h)下，實(shí)驗(yàn)組中葉綠素a含量接近零(t檢驗(yàn)，P＜0.01)，溶藻效果極顯著，計(jì)算得溶藻率達(dá)到97.4%.光照條件對(duì)細(xì)菌溶藻效果的影響，主要是對(duì)藻生長的影響，而對(duì)細(xì)菌生長的影響不大.在全黑暗下，藻細(xì)胞的光合作用停止，限制了藻對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，從而抑制了藻細(xì)胞的生長，在這種情況下，溶藻細(xì)菌更易侵蝕藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡.而在全光照條件下，藻細(xì)胞快速進(jìn)入生長期，生理狀態(tài)良好，不易受溶藻細(xì)菌的影響.這與史順玉等［22］的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)一株假單胞菌在全黑暗條件下對(duì)綠色微囊藻的溶藻效果最好.

圖6 不同光照條件對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響Fig.6 The lytic effect of bacteria B1on Phaeocystis globosa at different light condition

2.6 鹽度對(duì)溶藻效果的影響

不同海域海水中的鹽度是變化的，鹽度對(duì)細(xì)菌溶藻效果的影響見圖7.從圖7中可以看出在不同的鹽度下，對(duì)照組的葉綠素a含量相近，鹽度對(duì)藻細(xì)胞的生長基本無限制，這說明球形棕囊藻是鹽度適應(yīng)范圍廣的赤潮藻，在選定的鹽度范圍內(nèi)能正常生長.與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中當(dāng)鹽度為35‰時(shí)(t檢驗(yàn)，P＜0.01)，葉綠素a含量明顯低于其他鹽度下葉綠素a的含量，細(xì)菌B1溶藻效果極顯著，藻去除率達(dá)到93.1%.鹽度對(duì)溶藻效果的影響可能是因?yàn)橛绊懥思?xì)菌的生理性質(zhì)，通過破壞其內(nèi)部的生化反應(yīng)進(jìn)程使其不能吸收某些對(duì)細(xì)菌有益的物質(zhì)，從而使細(xì)菌的生長受到抑制，進(jìn)而影響其溶藻效果.

圖7 鹽度對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響Fig.7 Effect of bacteria B1 on growth of Phaeocystis globosa with different salinity

2.7 N和P含量變化對(duì)溶藻效果的影響

N和P是微生物生長的重要營養(yǎng)元素，實(shí)驗(yàn)采用改變?cè)迮囵B(yǎng)基中硝酸鈉和磷酸二氫鈉含量的方法探討了N、P元素對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響，結(jié)果見圖8.對(duì)比硝酸鈉(++)、硝酸鈉(-)、磷酸二氫鈉(++)、磷酸二氫鈉(-)中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量，通過葉綠素a的降低計(jì)算得到藻去除率分別為 56.8%、86.6%、72.6%、90.8%.實(shí)驗(yàn)表明，N和P含量加倍時(shí)細(xì)菌的溶藻效果較弱，減半時(shí)溶藻效果增強(qiáng);這是因?yàn)镹和P主要影響球形棕囊藻的生長，對(duì)細(xì)菌的影響相對(duì)較小.當(dāng)培養(yǎng)基中N和P含量增加時(shí)，促進(jìn)了藻的生長，從而降低了細(xì)菌的溶藻效果;而當(dāng)其含量降低時(shí)，藻的生長受到一定的抑制，使得溶藻效果增強(qiáng).

圖8 硝酸鈉和磷酸二氫鈉對(duì)細(xì)菌B1溶藻效果的影響Fig.8 Effect of B1 on growth of Phaeocystis globosa with different content of NaNO3and NaH2PO4

3 結(jié)論

(1)細(xì)菌B1對(duì)球形棕囊藻有較好的溶藻效果，細(xì)菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期時(shí)，對(duì)球形棕囊藻的溶藻效果最好，菌液的最佳添加量體積比為1%，藻去除率可以達(dá)到 92.7%.

(2)球形棕囊藻處于調(diào)整期時(shí)，藻細(xì)胞處于萌發(fā)階段，細(xì)菌抑藻效果較好，赤潮治理最佳時(shí)機(jī)為赤潮爆發(fā)初期.溫度和光照主要是影響球形棕囊藻的生長對(duì)溶藻效果造成一定的影響，在30℃和黑暗條件下細(xì)菌的溶藻效果極顯著.鹽度對(duì)球形棕囊藻生長影響不顯著，主要通過影響細(xì)菌的生理性質(zhì)影響溶藻效果，當(dāng)鹽度為35‰時(shí)細(xì)菌溶藻效果極顯著，說明在此鹽度海域用細(xì)菌方法治理赤潮效果更好.N和P含量對(duì)藻細(xì)胞生長的影響大于對(duì)細(xì)菌生長的影響，使細(xì)菌的溶藻效果在N和P含量較低時(shí)效果更好.

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