朱春紅，孟 霞，厚華艷，龔建森，張江英，朱國(guó)強(qiáng)

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

菌毛是革蘭氏陰性菌菌體表面的絲狀蛋白附屬物，又稱(chēng)柔毛、纖毛等，直徑為0.2～1.5 mm。沙門(mén)氏菌菌毛多由結(jié)構(gòu)蛋白亞單位組成，具有抗原性，與沙門(mén)氏菌的致病性相關(guān)。本文以GenBank上已經(jīng)公布的多株不同血清型沙門(mén)氏菌全基因組序列信息為參考，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，綜述不同血清型沙門(mén)氏菌菌毛操縱子編碼基因，分子結(jié)構(gòu)特征及其在沙門(mén)氏菌進(jìn)化、宿主嗜性、致病、感染擴(kuò)散中的可能作用。

1 沙門(mén)氏菌菌毛操縱子基因分類(lèi)

傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌菌毛分類(lèi)主要依據(jù)其形態(tài)和紅細(xì)胞凝集反應(yīng)性，但是在與環(huán)境以及宿主相互作用過(guò)程中，細(xì)菌基因組會(huì)發(fā)生堿基替換、基因轉(zhuǎn)移、染色體倒位，缺失或重組等變異現(xiàn)象，使得細(xì)菌遺傳信息發(fā)生變化，從而產(chǎn)生新的表型性狀，因此基于生物大分子（核酸和蛋白質(zhì)序列）信息的分類(lèi)方法則顯得相對(duì)客觀[1]。對(duì)已登錄GenBank的沙門(mén)氏菌全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，表明菌毛編碼基因操縱子廣泛存在于各種血清型的沙門(mén)氏菌基因組中，沙門(mén)氏菌基因組通常含有5～20種菌毛編碼基因操縱子，依據(jù)其可能的表達(dá)和組裝方式，菌毛主要分為下述三種類(lèi)型:

1.1 伴侶蛋白-推進(jìn)蛋白途徑類(lèi)( Chaperone/usher pathway, CUP )菌毛CUP類(lèi)菌毛即經(jīng)過(guò)伴侶蛋白-推進(jìn)蛋白途徑組裝和表達(dá)的菌毛，對(duì)于這種方式組裝與表達(dá)機(jī)制的菌毛國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有了較為深入的研究。目前研究的大部分菌毛都通過(guò)這種機(jī)制表達(dá)。這類(lèi)菌毛操縱子基因至少包括三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，菌毛亞單位蛋白編碼基因，伴侶蛋白編碼基因，推進(jìn)蛋白編碼基因，有時(shí)還有其他亞單位編碼基因，如次要亞單位蛋白基因（通常表達(dá)于菌毛頂端的粘附素性亞單位），調(diào)控基因等。菌毛亞單位蛋白通過(guò)在N-末端產(chǎn)生信號(hào)肽序列的方式直接進(jìn)入到細(xì)胞周質(zhì)間隙，N-末端信號(hào)肽序列在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中被降解，菌毛結(jié)構(gòu)亞單位蛋白在周質(zhì)間隙中與伴侶蛋白結(jié)合避免非活性形式的聚集或者被相關(guān)蛋白酶降解，然后在推進(jìn)蛋白的輔助作用下穿過(guò)外膜蛋白，正確組裝并成功表達(dá)于細(xì)菌表面。

研究者根據(jù)GenBank中已經(jīng)共享的沙門(mén)氏菌全基因組信息，對(duì)推進(jìn)蛋白編碼序列進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)一步將CUP類(lèi)菌毛分為以下6個(gè)亞類(lèi):δ型，α型，β型，γ型，κ型和π型（圖1）。分析圖1中列出的17株沙門(mén)氏菌菌株的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)腸道沙門(mén)氏菌腸科亞種除亞利桑那沙門(mén)氏菌基因組僅含5個(gè)CUP類(lèi)菌毛編碼基因簇外，其他腸科亞種沙門(mén)氏菌基因組中均含有11-13種不同CUP類(lèi)菌毛編碼操縱子；邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌則含有8個(gè)CUP類(lèi)菌毛編碼基因簇[2]；比對(duì)大腸桿菌參考菌株K-12株序列，發(fā)現(xiàn)其和腸道沙門(mén)氏菌腸科亞種菌株相似，同時(shí)分析到12種之多的CUP類(lèi)菌毛編碼基因[3]。

1.2 成核沉淀途徑(nucleation-precipitation pathway)類(lèi)菌毛沙門(mén)氏菌中，成核沉淀途徑類(lèi)菌毛主要為細(xì)凝 集 性 菌 毛（thin aggregative fimbriae，Tafi）， 由操縱子基因agfDEFG、agfBA編碼和轉(zhuǎn)錄[5,6]，這類(lèi)菌毛形態(tài)和其他菌毛不同，直徑3～4 nm，其在菌體表面呈現(xiàn)一種異聚體蛋白絲狀形態(tài)，由一個(gè)獨(dú)特的方式—成核沉淀方式組裝表達(dá)展呈于菌體表面。

圖1 沙門(mén)氏菌菌毛操縱子分類(lèi)[4]Fig.1 Classifi cation of Salmonella fi mbriae

沙門(mén)氏菌Tafi菌毛和大腸桿菌卷曲菌毛（Curli菌毛）高度同源，目前對(duì)大腸桿菌Curli菌毛的組裝機(jī)制研究比較深入。大腸桿菌Curli菌毛同樣是由操縱子基因操縱子 csg（curli subunit genes）(csgDEFG、csgBA) 編碼和轉(zhuǎn)錄[7]，csgBA編碼的亞基CsgB和CsgA通過(guò)信號(hào)肽的方式分泌到周質(zhì)中，CsgD調(diào)控csgBA的轉(zhuǎn)錄，CsgG是一種外膜脂蛋白，與CsgE結(jié)合協(xié)助CsgA和CsgB完成跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)；在沙門(mén)氏菌中，AgfA是Tafi菌毛的主要亞單位蛋白，其含有標(biāo)準(zhǔn)的信號(hào)肽序列，在AgfG亞單位的協(xié)同作用下通過(guò)細(xì)胞周質(zhì)間隙，完成跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)[8]，次要亞單位蛋白AgfB，又稱(chēng)為nucleator，與分泌出的AgfA單體成核沉淀成不溶性的β折疊結(jié)構(gòu)[9]，在菌體表面形成淀粉纖維樣沉淀物[10]。成核沉淀方式與伴侶蛋白-推進(jìn)蛋白方式最主要不同之處在于，CUP類(lèi)菌毛是在周質(zhì)間隙中菌毛亞基蛋白發(fā)生聚合，而Curli菌毛和Tafi菌毛組裝則發(fā)生在細(xì)菌外膜上。

1.3 Ⅳ型菌毛Ⅳ型菌毛是主要分布于革蘭氏陰性致病菌表面的一種強(qiáng)韌細(xì)絲狀纖毛，為纖毛蛋白的多聚體，多位于細(xì)菌細(xì)胞的一端。根據(jù)其主要亞單位蛋白的同源性，可以分為兩類(lèi):ⅣA型和ⅣB型。ⅣA型菌毛含有較短的先導(dǎo)氨基酸序列和成熟的氨基酸序列，其宿主范圍較廣，可分布于人類(lèi)、其他哺乳動(dòng)物、植物、真菌和各種細(xì)菌表面；ⅣB型菌毛氨基酸序列較長(zhǎng)，只分布于腸道細(xì)菌表面。

分析比對(duì)已發(fā)表的沙門(mén)氏菌株全基因組信息發(fā)現(xiàn)，僅少數(shù)屬沙門(mén)氏菌含ⅣB型菌毛操縱子基因，如:邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌的sbeTABCDEFGHIP操縱子，傷寒沙門(mén)氏菌的pilM（N'，N）OPQRSTUV操縱子，B型副傷寒沙門(mén)氏菌和海德堡沙門(mén)氏菌基因組也含有類(lèi)似的同源的操縱子序列[11,12]。

Ⅳ型菌毛的結(jié)構(gòu)研究報(bào)道在銅綠假單胞菌和奈瑟琳球菌中較多。他們的組成成分和Ⅱ型分泌系統(tǒng)的成分有同源性，包括菌毛蛋白、前菌毛肽酶、有或無(wú)核苷結(jié)合基序的可溶性蛋白、膜內(nèi)蛋白和形成寡聚圓環(huán)結(jié)構(gòu)的外膜蛋白。Ⅳ型菌毛蛋白最初是由一個(gè)菌毛蛋白亞基開(kāi)始形成，在這個(gè)基礎(chǔ)上結(jié)構(gòu)前體蛋白經(jīng)過(guò)前菌毛蛋白肽酶的裂解，前菌毛蛋白肽酶有雙重功能(生成菌毛蛋白結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)細(xì)菌外分泌系統(tǒng))，他能同時(shí)使成熟菌毛蛋白的第一個(gè)氨基酸(苯丙氨酸或甲硫氨酸)甲基化。Ⅳ型菌毛亞基是在內(nèi)膜周質(zhì)中組裝形成，在聚集成菌毛蛋白纖維之前，菌毛蛋白分子通過(guò)N端高度保守的疏水性區(qū)域的氨基酸先附著在內(nèi)膜上，傷寒沙門(mén)氏菌的菌毛亞基pilin通過(guò)普遍分泌方式（產(chǎn)生信號(hào)肽的分泌方式）轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中，并錨定在內(nèi)膜上，向外膜拉伸形成完整的菌毛[13]。

2 菌毛基因操縱子的遺傳變異

通過(guò)對(duì)17株測(cè)序完成的沙門(mén)氏菌株全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，腸道沙門(mén)氏菌含有多達(dá)11～13種之多的菌毛操縱子基因，且每種沙門(mén)氏菌基本上都含有一種或多種標(biāo)準(zhǔn)的CUP類(lèi)菌毛蛋白。雖然菌毛種類(lèi)極富多樣性，但直系同源的沙門(mén)氏菌菌毛基因操縱子通常位于基因組序列中相似的位置，據(jù)報(bào)道，沙門(mén)氏菌一旦獲得某種菌毛操縱子基因序列，則能通過(guò)垂直遺傳和水平遷移（包括同源重組，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)）等方式進(jìn)行遺傳[4]。

序列信息分析表明bcf、fim、sth菌毛操縱子基因在沙門(mén)氏菌屬內(nèi)高度保守，而lpf、peg、saf、stb、stc、std、ste、stf和sti這9種菌毛基因操縱子基因同源性能大于45%，但是其他菌毛操縱子基因同源性則小于45%[4]。

研究者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)了D群部分沙門(mén)氏菌SEF14菌毛基因操縱子的變異情況，研究共檢測(cè)了18株雞白痢沙門(mén)氏菌、11株腸炎沙門(mén)氏菌以及1株都柏林沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株sefA、sefD和sefR基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sefA、sefD以及sefR基因在腸炎沙門(mén)氏菌和都柏林沙門(mén)氏菌中普遍存在，并和已發(fā)表的序列100%同源，但sefD和sefR基因在雞白痢沙門(mén)氏菌中或發(fā)生堿基缺失，或無(wú)相應(yīng)PCR產(chǎn)物，說(shuō)明SEF14菌毛基因操縱子在雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了變異，這一變異很可能是雞白痢沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌同屬D群沙門(mén)氏菌，卻不能表達(dá)SEF14菌毛的原因之一[14]。

3 沙門(mén)氏菌菌毛生物學(xué)功能

多數(shù)致病菌富含多種菌毛結(jié)構(gòu)，如腸道致病菌腸炎沙門(mén)氏菌。目前對(duì)多種菌毛結(jié)構(gòu)的生物組裝及分泌機(jī)制研究較多，但對(duì)這些菌毛結(jié)構(gòu)在沙門(mén)氏菌中的致病作用仍了解甚少。

3.1 CUP類(lèi)菌毛沙門(mén)氏菌基因組中含有豐富的CUP類(lèi)菌毛編碼基因操縱子序列，但對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物—菌毛蛋白在病原菌與易感宿主之間的相互關(guān)系仍未能深入研究。目前研究最廣泛的I型菌毛，是由fim操縱子編碼的，在靜置條件下表達(dá)于所有的檢測(cè)的沙門(mén)氏菌血清型中。FimA是I型菌毛的主要蛋白亞基，形成菌毛的主干部分，對(duì)宿主趨性有影響，但關(guān)于FimA的功能還存在爭(zhēng)議[15,16]；FimH位于菌毛頂端，其氨基酸序列差異決定不同菌種或不同血清型的I型菌毛與不同宿主細(xì)胞特異性粘附。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌FimH優(yōu)先結(jié)合到膀胱上皮細(xì)胞，而沙門(mén)氏菌FimH結(jié)合腸細(xì)胞[16]。FimH在結(jié)合的特異性上的變化不受血清型限制,但是對(duì)相同血清型的菌株的FimH進(jìn)行誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)合特性。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中，存在高粘附性和低粘附性?xún)蓚€(gè)FimH變種[15,17]，高粘附性變種FimH對(duì)人類(lèi)上皮細(xì)胞系有更高的親和力，低粘附性變種FimH和腸炎沙門(mén)氏菌的FimH有同樣的結(jié)合特性，屬于甘露糖敏感型，體外實(shí)驗(yàn)中能同時(shí)結(jié)合人膀胱上皮細(xì)胞系和人結(jié)腸上皮細(xì)胞系[17,18]，不同于低粘附性變種FimH，高粘附性變種FimH對(duì)不同細(xì)胞系的粘附能力差異較大[18]。

研究者所在實(shí)驗(yàn)室正致力于限制性表達(dá)于腸炎沙門(mén)氏菌等D群沙門(mén)氏菌的SEF14菌毛的生物學(xué)功能探索，部分研究數(shù)據(jù)顯示SEF14菌毛能在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下表達(dá)。SEF14菌毛優(yōu)化表達(dá)后，可以使活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)SEF14菌毛主要亞單位突變株吞噬作用增強(qiáng)，借助SEF14菌毛的作用，腸炎沙門(mén)氏菌能更好的作用于巨噬細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活[19]。

3.2 細(xì)凝集性菌毛細(xì)凝集性菌毛除了組裝方式和其他菌毛區(qū)別外，其還有一些獨(dú)特的生物學(xué)特性。細(xì)凝集性菌毛編碼基因在多種屬細(xì)菌中高度保守如:檸檬桿菌屬（Citrobacter），腸桿菌屬（Enterobacter），埃希氏菌屬（Escherichia），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）,沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）和志賀氏桿菌屬（Shigella）[20]。細(xì)凝集性菌毛在沙門(mén)氏菌以及大腸桿菌中是生物膜形成的基質(zhì)成分之一，細(xì)凝集性菌毛促進(jìn)細(xì)菌在基質(zhì)表面，特別是無(wú)生命物質(zhì)表面，如玻璃、聚丙烯、聚氯乙烯等物質(zhì)表面形成生物膜，細(xì)凝集性菌毛相互纏結(jié)，把鄰近的細(xì)菌聯(lián)接成小菌群，逐漸發(fā)育為生物膜[21]。另外，細(xì)凝集性菌毛能作為病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）被TLR2識(shí)別，啟動(dòng)先天性免疫保護(hù)作用。最新的研究表明，TLR2能啟動(dòng)宿主及病原源性的纖維淀粉樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)的先天性免疫反應(yīng)[22]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌致?；啬c袢炎的試驗(yàn)中，病菌侵襲后，機(jī)體對(duì)細(xì)凝集性菌毛淀粉樣蛋白的識(shí)別能啟動(dòng)前炎性因子的生成和中性粒細(xì)胞的聚集[23]。

3.3 Ⅳ型菌毛目前關(guān)于Ⅳ型菌毛的生物學(xué)功能在假單胞菌屬和奈瑟菌屬研究相對(duì)較多，在沙門(mén)氏菌屬中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。革蘭氏陰性細(xì)菌在半固體表面如黏膜表面可有一種特有的運(yùn)動(dòng)形式，在黃黏球菌中這種運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為滑行運(yùn)動(dòng)，而在假單胞菌屬和奈瑟菌屬中的運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為蹭行運(yùn)動(dòng)。研究者運(yùn)用鐳射顯微光鉗系統(tǒng)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奈瑟球菌通過(guò)Ⅳ型菌毛的伸縮運(yùn)動(dòng)完成在介質(zhì)表面的運(yùn)動(dòng)，而其中PilT蛋白復(fù)合體起到了重要的作用[24]；相關(guān)研究還證明蹭行運(yùn)動(dòng)能激活宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)，介導(dǎo)早期的前炎癥因子的釋放，如IL-8，IL-6等[25]。Ⅳ型菌毛能通過(guò)自聚集在靶組織表面形成微克隆菌群，這種特性和Ⅳ型菌毛介導(dǎo)的介質(zhì)表面運(yùn)動(dòng)共同參與了細(xì)菌生物膜的形成。Kube等[25]用實(shí)時(shí)共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌會(huì)逐漸游弋形成蘑菇狀的生物膜，提示了Ⅳ型菌毛在生物膜形成中的作用。Ⅳ型菌毛還參與一些致病過(guò)程比如免疫逃避、DNA吸收、生物膜形成、微菌落形成、粘附等。傷寒沙門(mén)氏菌Ⅳ型菌毛通過(guò)囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子（CFTR）來(lái)完成附著和吸收，CFTR的水平與傷寒沙門(mén)氏菌的吸收效率相聯(lián)系。prePil結(jié)合到CFTR上介導(dǎo)傷寒沙門(mén)氏菌與腸上皮細(xì)胞的粘附。有趣的是，囊性纖維化的CFTR突變株△F508，小鼠粘膜下層細(xì)胞對(duì)突變株的吸收嚴(yán)重下降。帶有雜合子的突變株對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌感染的敏感性降低[26-28]。上述研究均提示Ⅳ型菌毛在沙門(mén)氏菌屬相關(guān)血清型細(xì)菌中的重要生物學(xué)致病作用，有較高研究?jī)r(jià)值。

4 菌毛基因操縱子與宿主嗜性

沙門(mén)氏菌菌毛操縱子基因的多樣性分布可能與沙門(mén)氏菌的宿主嗜性相關(guān)[29]，爬行動(dòng)物等冷血?jiǎng)游锊痪哂忻庖哂洃浤芰?，相?yīng)的冷血?jiǎng)游镞m應(yīng)性沙門(mén)氏菌則含有較少種類(lèi)的菌毛操縱子基因，如:亞利桑那沙門(mén)氏菌含有5種菌毛操縱子基因，邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌含有8種菌毛操縱子基因(見(jiàn)圖2)。

傷寒沙門(mén)氏菌以及甲乙丙三型副傷寒等血清型沙門(mén)氏菌是高度適應(yīng)于人類(lèi)的沙門(mén)氏菌，對(duì)其他動(dòng)物不引起自然感染。對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的測(cè)序結(jié)果分析表明這一血清型沙門(mén)氏菌分化于5萬(wàn)年前[30]。和引起局部腸炎的其他相近血清型沙門(mén)氏菌相比，傷寒沙門(mén)氏菌能導(dǎo)致感染宿主的全身性敗血癥反應(yīng)[31]，且長(zhǎng)期的膽囊?guī)Ь?。在此感染機(jī)制下，傷寒沙門(mén)氏菌表現(xiàn)為多樣性菌毛操縱子基因的失活，成為假基因，這一推論表現(xiàn)為傷寒沙門(mén)氏菌CT18株11個(gè)菌毛操縱子基因中7個(gè)演變?yōu)榧倩?，Ty2株則8個(gè)菌毛操縱子基因演變?yōu)榧倩颍▓D2）。研究者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)SEF14菌毛操縱子基因的遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，部分雞白痢沙門(mén)氏菌菌株SEF14菌毛亞單位編碼基因sefD演變?yōu)榧倩?，表明此遺傳變異可能與雞白痢沙門(mén)氏菌的專(zhuān)嗜性相關(guān)[14]。

這種宿主偏嗜性沙門(mén)氏菌中菌毛操縱子基因的失活為假基因是一種趨勢(shì)，但是也存在一些例外，如乙型副傷寒沙門(mén)氏菌一共11種菌毛操縱子基因，只有1個(gè)失活為假基因，其他10個(gè)仍是完整的菌毛操縱子基因。這一現(xiàn)象的可能解釋是B型副傷寒是出現(xiàn)較晚的宿主偏嗜性沙門(mén)氏菌[32]。上述研究表明，假基因的出現(xiàn)以及積累是宿主偏嗜性沙門(mén)氏菌利用菌毛操縱子基因失活以趨同方式適應(yīng)單一宿主的模式[33]。

圖2 不同血清型沙門(mén)氏菌CUP類(lèi)菌毛操縱子假基因的比例[4]Fig.2 Chaperone/usher fi mbriae repertoire pseudogene content amongst the analysed Salmonella serovars

5 展望

沙門(mén)氏菌菌毛操縱子基因的多樣性分布可能是不同血清型沙門(mén)氏菌適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)，對(duì)不同菌毛在沙門(mén)氏菌致病及傳播過(guò)程中的作用，對(duì)不同菌毛的鑒定及功能解析等研究還有待加強(qiáng)。相信隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，沙門(mén)氏菌菌毛的結(jié)構(gòu)和功能研究也會(huì)不斷深入，菌毛在沙門(mén)氏菌特異性檢測(cè)與預(yù)防控制方面將會(huì)發(fā)揮極其重要的作用。

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