劉 齊, 楊 芳, 杜 萍, 張叢蘭, 楊登想,*

(1.湖北大學(xué)知行學(xué)院,湖北武漢 430011;2.昆明理工大學(xué)分析測試研究中心,云南昆明 650093;3.云南省分析測試中心,云南昆明 650093)

板栗俗稱栗子,有“干果之王”的美稱.對板栗入藥的使用在歷代的醫(yī)藥古籍中都有記載,栗殼為板栗的外果皮,藥性甘、澀、平,具有降逆、止血的功效,主治反胃、鼻衄、便血等癥[1].

多糖(polysaccharide)也稱聚(合)糖是能被水解生成許多單糖的糖類,為單糖的縮聚物,一般為非晶體物質(zhì).多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì),而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物[2].不均一多糖通過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白聚糖發(fā)揮生物學(xué)功能[3-4],如作為機(jī)體潤滑劑、血型物質(zhì)的基本成分等.20世紀(jì)80年代以來,科學(xué)家對植物多糖,特別是對中藥中的多糖研究產(chǎn)生了濃厚興趣[5],近年來,有學(xué)者對于板栗多糖功能活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)板栗多糖具有清除自由基,抗氧化等多種功能活性[6].

正因?yàn)榘謇醯膶?shí)用以及藥用價(jià)值,所以現(xiàn)在對板栗的各部分都進(jìn)行了一定的基礎(chǔ)理論研究和探討[6-7]。本實(shí)驗(yàn)主要以板栗殼中多糖為研究對象,分別利用超聲波提取法、水提法和堿提法對板栗殼中多糖進(jìn)行提取,以提取率作為評價(jià)指標(biāo),比較出更加適合板栗殼多糖提取的方法,為后續(xù)板栗殼多糖功能性研究提供技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

板栗是殼斗科栗屬中國板栗(Castanea mollissima),采自湖北省羅田縣,板栗在4℃條件下貯藏,實(shí)驗(yàn)前取殼做待測材料.乙醚、乙醇、丙酮、硫酸、三氯甲烷、正丁醇、蒽酮、NaOH均為分析純.

722型分光光度計(jì),上海天普分析儀器制造廠;超聲波萃取儀,上海比朗儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

參照文獻(xiàn)[7-9]的方法對樣品預(yù)處理:研磨成粉→乙醚去脂→乙醇去蛋白→活性炭脫色→干燥.

板栗殼用粉碎機(jī)粉碎,過篩40目,利用無水乙醚索氏抽提6～12 h,取粉末,棄脂肪.然后利用無水乙醇,以1 mg/mL的質(zhì)量濃度浸泡提取4 h,去除蛋白.最后分別用少量95%乙醇和丙酮洗滌.所得粉末樣品經(jīng)活性炭粉脫色、干燥備用.

1.2.2 多糖提取和除雜

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樣品2 g于錐形瓶中,分別進(jìn)行超聲波提取、水提取和堿提取.提取后的混合液用真空泵抽濾,取20 mL,移入分液漏斗中分離濾液,加入三氯甲烷和正丁醇(V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1)混合萃取液10 mL[10],劇烈振蕩20 min使其充分混勻提取上清液,除去蛋白質(zhì)[11].反復(fù)多次,至不再出現(xiàn)灰白色黏液為止.并將上清液取5.0 mL移入50 mL容量瓶中定容,得到上清稀釋液[12].

1.2.3 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL依次置于6個(gè)試管中,再分別加入去離子水至1.0 mL.搖勻后,按順序向試管中加入新配置的0.5 mL蒽酮的乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸,立即將試管放入沸水浴中,準(zhǔn)確保溫10 min,取出后自然冷卻至室溫,以空白作對照,在620 nm波長下測其吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程.

1.2.4 多糖含量測定

取經(jīng)提純除雜后的樣品提取液1 mL于比色管中,加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸,充分振蕩,立即將試管放入沸水浴中,準(zhǔn)確保溫10 min,取出后自然冷卻至室溫,并在620 nm波長處測定吸光值(A)[14],以1 mL蒸餾水作空白對照.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量,并計(jì)算多糖的提取率.

1.2.5 產(chǎn)品提取率的計(jì)算

所有數(shù)據(jù)均利用SPSS Statistics 20軟件分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程

建立的多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.005x;R2=0.996 5,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,其中縱軸為吸光度;橫軸為質(zhì)量濃度,μg/mL.

2.2 超聲波提取法

2.2.1 功率的影響

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

板栗殼經(jīng)預(yù)處理之后,以蒸餾水為提取溶劑,在料液比(樣品質(zhì)量濃度)為1∶90(g/mL),作用時(shí)間為20 min條件不變的情況下,研究不同功率下對板栗殼多糖提取率的影響,其結(jié)果如圖2.由圖2可以看出,當(dāng)超聲波功率為150 W時(shí),多糖得率較高,故取150 W進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖2 不同超聲波功率對板栗殼多糖提取率的影響Fig.2 Effects of different powers of ultrasonic extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.2.2 時(shí)間的影響

在超聲波功率150 W,料液比為1∶90(g/mL)的條件下,研究不同提取時(shí)間對板栗殼多糖提取率的影響,結(jié)果如圖3.由圖3可以看出,當(dāng)超聲波提取時(shí)間為25 min的時(shí)候,提取率較高.因此取25 min進(jìn)行正交試驗(yàn).

圖3 不同超聲波作用時(shí)間對板栗殼多糖提取率的影響Fig.3 Effects of different time of ultrasonic extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.2.3 料液比的影響

在選定功率為150 W,時(shí)間25 min的條件不變的情況下,研究不同料液比對板栗殼多糖提取率的影響,其結(jié)果如圖4.由圖4可以看出,料液比為1∶70(g/mL)時(shí)提取率較大,故取料液比為1∶70(g/mL)做正交試驗(yàn).

圖4 超聲波提取中不同料液比對板栗殼多糖提取率的影響Fig.4 Effects of different liquid ratio of ultrasonic extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

以料液比、提取時(shí)間、提取功率為影響因素,采用正交試驗(yàn)確定各因素對板栗殼多糖提取率的影響,選用L9(33)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn),以多糖得率為指標(biāo)優(yōu)選較佳提取工藝.正交試驗(yàn)及結(jié)果見表1.

表1 超聲波提取法正交試驗(yàn)及結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal design for yield of chestnut shells polysaccharides by ultrasonic extraction

由表1可知,在超聲波提取板栗殼多糖的實(shí)驗(yàn)中,各因素對多糖提取率的影響依次為:作用時(shí)間＞功率＞料液比.其實(shí)驗(yàn)的較佳組合為A1B3C3.進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到多糖提取率的平均值為9.15%.

2.3 水提取法

2.3.1 溫度的影響

在料液比1∶80(g/mL),時(shí)間3 h,次數(shù)1次的條件下,研究不同提取溫度對于板栗殼多糖提取率影響,結(jié)果見圖5.從圖5可以看出,在80℃時(shí)提取率較大,故取80℃做正交試驗(yàn).

圖5 水提法中不同提取溫度對板栗殼多糖提取率的影響Fig.5 Effects of different temperature of water extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.3.2 料液比的影響

在溫度為80℃,提取時(shí)間為3 h,提取次數(shù)為1次的條件下,研究不同料液比對于板栗殼多糖提取率的影響,其結(jié)果如圖6.由圖6可以看出,隨著料液比加大,吸光度的變化呈W型,在料液比為1∶90(g/mL)時(shí)達(dá)到較大,之后還有上升趨勢,鑒于在工業(yè)生產(chǎn)中加大料液比會增加生產(chǎn)成本,因此料液比設(shè)計(jì)在 1∶90(g/mL).

圖6 水提法中不同料液比對板栗殼多糖提取率的影響Fig.6 Effects of different liquid ratio of water extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.3.3 時(shí)間的影響

在溫度為80℃,提取次數(shù)為1次,料液比1∶80(g/mL)條件下,研究不同提取時(shí)間對于板栗殼多糖提取率的影響,其結(jié)果如圖7.由圖7可知,提取時(shí)間為2.5 h時(shí)提取率較大,隨后開始減小,故取2.5 h做正交試驗(yàn).

圖7 水提法中不同提取時(shí)間對板栗殼多糖提取率的影響Fig.7 Effects of different hours of water extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.3.4 提取次數(shù)的影響

在其他相同條件下提取不同次數(shù),測定結(jié)果如圖8.從圖8可以看出,提取次數(shù)越大,吸光度越小,即提取一次時(shí)提取率較大,因此在實(shí)際生產(chǎn)中,應(yīng)選擇提取一次.

圖8 水提法中提取次數(shù)對板栗殼提取率的影響Fig.8 Effects of different times of water extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.3.5 水提取法正交試驗(yàn)

水提取法對板栗殼多糖正交試驗(yàn)及結(jié)果見表2.由表2可以看出水提法提取板栗殼多糖的實(shí)驗(yàn)中提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比的影響順序?yàn)?提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比＞提取次數(shù),也就是說提取溫度影響較大.確定較佳組合為A2B2C1D3,即提取的較優(yōu)水平為:提取溫度90℃,提取時(shí)間2 h,料液比為1∶90(g/mL),提取2次.按照該條件做重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次計(jì)算提取率平均值為5.99%.

2.4 堿提取法

2.4.1 料液比的影響

在溫度70℃,0.5 mol/L的NaOH溶液提取2 h,提取1次的條件不變的情況下,研究不同料液比對板栗殼多糖提取率的影響,結(jié)果如圖9.

表2 水提法正交試驗(yàn)及結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal design for yield of chestnut shells polysaccharides by water extraction

圖9 堿提法中不同料液比對板栗殼多糖得率的影響Fig.9 Effects of different liquid ratio of alkali extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

由圖9知,當(dāng)料液比處于1∶45(g/mL)時(shí)提取率較大,故取料液比為1∶45(g/mL)做正交試驗(yàn).

2.4.2 溫度的影響

在0.5 mol/L的NaOH溶液提取2 h,料液比為1∶40(g/mL),提取1次條件不變的情況下,研究不同提取溫度對于板栗殼多糖提取率的影響,結(jié)果如圖10.由圖10可知應(yīng)當(dāng)選用80℃做正交試驗(yàn).

圖10 堿提法中不同提取溫度對板栗殼多糖得率的影響Fig.10 Effects of different temperature of alkali extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.4.3 堿濃度的影響

在溫度為70℃,提取2 h,料液比為1∶40(g/mL),提取1次條件不變的情況下,研究不同堿濃度對提取率的影響,其結(jié)果如圖11.由圖11知,應(yīng)當(dāng)選用0.6 mol/L氫氧化鈉做正交實(shí)驗(yàn).

圖11 堿提法中不同堿濃度對板栗殼多糖得率的影響Fig.11 Effects of different concentration of alkali extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

2.4.4 時(shí)間的影響

在溫度為70℃,0.5 mol/L的NaOH溶液,料液比為1∶40(g/mL),提取1次條件不變的情況下,分別提取20,30,60,90,120,150 min,多糖的提取率變化如圖12.由圖12知,提取時(shí)間為90 min較佳,此時(shí)提取率最大.應(yīng)當(dāng)選用提取90 min做正交試驗(yàn).

2.4.5 堿液提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

在堿液提取法板栗殼多糖時(shí),料液比,提取溫度,提取時(shí)間和堿濃度均對提取效果產(chǎn)生影響(見表3),其中最為顯著的是提取溫度,其次是料液比,影響較小的是提取時(shí)間和提取液濃度,即各因素對提取率影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D.較優(yōu)水平組合為A3B3C1D1,即較佳提取條件為:用0.5 mol/L的氫氧化鈉,在1∶50(g/mL)的料液比下,于90℃水浴中提取60 min,在此條件下提取板栗殼中的多糖三次,多糖的提取率為4.72%.

圖12 堿提法中不同提取時(shí)間對板栗殼得率的影響Fig.12 Effect of different hours of alkali extraction on yield of chestnut shells polysaccharides

表3 堿提法正交試驗(yàn)因素水平表Tab.3 Results of orthogonal design for yield of chestnut shells polysaccharides by alkali extraction

2.5 提取方法結(jié)果比較

對超聲波提取法、水提取法、堿提取法提取法3種方法優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),3種方法提取率之間均呈現(xiàn)顯著性差異(p＜0.01).超聲波提取率最高,能夠達(dá)到9.15%.同時(shí)相比于其他2種提取方式而言其提取時(shí)間只需要30 min,遠(yuǎn)少于其他2種方法,且在室溫下便可進(jìn)行,提取條件相對溫和.堿提法雖然在多數(shù)文獻(xiàn)中運(yùn)用較多[15-22],但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示該方法中堿液消耗較大且提取率最差.因此,在板栗殼多糖提取的過程中,應(yīng)當(dāng)首要考慮超聲波提取的方法而放棄堿提法.

3 結(jié) 論

經(jīng)比較在通過正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝之后,超聲波提取法的提取率為9.15%,水提取法的提取率為5.99%,堿提取法的提取率為4.72%.由此看出超聲波提取法的提取效果較好,超聲波提取法的較佳工藝的功率為125 W,超聲波時(shí)間為30 min,料液比為1∶90(g/mL).同時(shí),相對于堿提取法和水提取法而言,超聲波提取法不會產(chǎn)生大量的廢水,其環(huán)保、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)亦不容忽視.

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