李 靖, 陳 偉, 程 芳, 劉錦繡, 李小永, 司玉慧

(1.山東銀香偉業(yè)集團(tuán)公司,山東曹縣 274400;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;3.煙臺南山學(xué)院,山東煙臺 265713)

酸豆奶是大豆制漿(即豆乳)后,加入少量奶粉或新鮮牛奶及某些可供益生菌利用的糖類作為發(fā)酵促進(jìn)劑,經(jīng)益生菌發(fā)酵而成[1-2].酸豆奶既保留了豆奶的營養(yǎng)成分,又破壞了大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子.由于微生物和酶的作用,酸豆奶中的大豆蛋白被降解成易吸收的小分子肽和氨基酸,利于人體消化吸收,具有很高的營養(yǎng)價值[3].

香菇是藥食兩用菌類,營養(yǎng)豐富,因含有香菇多糖、香菇嘌呤[4]、氨基酸等多種有效成分而備受關(guān)注,特別是其中的香菇多糖具有顯著的、獨(dú)特的抗腫瘤活性[5].香菇發(fā)酵液中含有與香菇子實(shí)體相同的營養(yǎng)成分,而且含量均高于香菇子實(shí)體,是其防病抗衰的物質(zhì)基礎(chǔ),而且香菇發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于香菇子實(shí)體.以香菇發(fā)酵液和豆奶為原料制作香菇酸豆奶,集香菇與豆奶的營養(yǎng)成分于一體,有很高的營養(yǎng)價值和市場潛力.

近年來,有報道以鮮牛乳和提取的香菇汁為主要原料,研制香菇酸奶[6-7].有關(guān)香菇酸豆奶的研究鮮有報道.本研究以香菇發(fā)酵液、豆?jié){和脫脂奶為原料制作酸豆奶,通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝,測定分析其營養(yǎng)成分,為產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

材料:香菇菌種、脫脂奶、豆?jié){、發(fā)酵劑(含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌,實(shí)驗(yàn)室保存).

儀器:YXQG02型手提式滅菌鍋,山東新華醫(yī)療器械有限公司;LRH-250型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;ANKE TGL-16L型飛鴿牌離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;Unic 2000型分光光度計,優(yōu)尼科有限公司;DeLTA320型酸度計,梅特勒托利多公司;SW-CJ-1CU型潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HYG-B型全溫度搖瓶柜,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;BS 124S型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香菇發(fā)酵液的制備[8]

1)將香菇菌種分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)4～6 d,直至斜面上長滿菌絲.

2)在無菌條件下,將斜面菌種分別接種到滅菌的香菇種子培養(yǎng)基中,28℃下恒溫震蕩培養(yǎng)5～7 d,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min;待培養(yǎng)液清亮,有小的菌絲球形成即制成種子液.

3)在無菌條件下,將種子液分別接種到滅菌的香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%(體積比);接種后,在28℃下恒溫培養(yǎng)4～6 d,搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min;待培養(yǎng)液清亮,收集發(fā)酵液.發(fā)酵濾液過濾后滅菌備用.

1.2.2 香菇酸豆奶的制作流程

將豆?jié){、脫脂奶與蔗糖、明膠按一定比例調(diào)配混勻,95℃滅菌10 min,待冷卻至40℃左右,加入滅菌的香菇發(fā)酵液,攪拌混勻,按比例接種發(fā)酵劑,42℃保溫發(fā)酵4～6 h,待其凝固后,在4℃冰箱中后發(fā)酵24 h,即得到成品,并進(jìn)行感官評定與理化檢測.

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

選取對香菇酸豆奶發(fā)酵工藝有顯著影響的4個因素,即發(fā)酵劑添加量(質(zhì)量比)、豆?jié){和脫脂奶添加比例(體積比)、香菇發(fā)酵液添加量(體積比)和明膠添加量(質(zhì)量比)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).按照感官評分標(biāo)準(zhǔn)對香菇酸豆奶進(jìn)行感官評分,并測定酸度和持水力.

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計原理,以香菇發(fā)酵液添加量、蔗糖添加量、明膠添加量為響應(yīng)面試驗(yàn)因素,設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),以感官評分和持水力為響應(yīng)值,建立數(shù)學(xué)模型,確立香菇酸豆奶的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件.并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

1.2.5 感官評分

參照酸乳衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2003[9]進(jìn)行鑒評,香菇酸豆奶品質(zhì)鑒評時由10名有感官品評經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員組成鑒評小組,按規(guī)定的評分標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品的感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評價,評價指標(biāo)包括產(chǎn)品組織狀態(tài)、風(fēng)味、口感,分?jǐn)?shù)分別為10、10、10,滿分為30分,取平均值為最終結(jié)果.

1.2.6 理化指標(biāo)的測定

1)乳酸菌計數(shù):依據(jù)國標(biāo) GB/T 4789.35—2010[10]進(jìn)行測定.

2)酸度測定:NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法.

3)持水力測定:離心稱重[11].

4)丁二酮含量的測定采用鄰苯二胺比色法;乙醛含量的測定采用碘液滴定法,參照文獻(xiàn)[12].

5)蛋白質(zhì)含量的測定:考馬斯亮藍(lán)比色法,參照文獻(xiàn)[13].

6)氨基酸含量的測定:甲醛電位滴定法,參照文獻(xiàn)[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵劑添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響

確定豆?jié){與脫脂奶的比例為3∶8,蔗糖添加量為6%(質(zhì)量比),發(fā)酵劑添加量分別為0.05%,0.10%,0.15%,0.20%時,對酸奶品質(zhì)的影響見表1.

表1 發(fā)酵劑添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響Tab.1 Effect of addition of fermentation agent on soybean milk yogurt quality

發(fā)酵劑添加量作為發(fā)酵過程的主要因素直接影響發(fā)酵時間和成品的質(zhì)量,從表1中看出,當(dāng)添加量在0.10%時感官評分和持水力最好,酸度在指標(biāo)要求范圍內(nèi).隨著添加量的增加,產(chǎn)酸量增加,但酸豆奶口感逐漸變酸,持水力變差,這是因?yàn)樘砑恿窟^大,產(chǎn)酸過快,造成凝乳中蛋白質(zhì)脫水收縮[15],乳清析出增多,影響酸豆奶的質(zhì)量.所以選擇發(fā)酵劑添加量為0.10%作為實(shí)驗(yàn)的固定參數(shù).

2.1.2 豆?jié){與脫脂奶添加比例對酸豆奶品質(zhì)的影響

確定蔗糖添加量為6%,發(fā)酵劑添加量為0.10%.考察豆?jié){和脫脂奶添加比例分別為0∶11,1∶10,2∶9,3∶8和 4∶7時,對酸豆奶感官評分、酸度和持水力的影響,結(jié)果見表2.

表2 豆?jié){和脫脂奶比例對酸豆奶品質(zhì)的影響Tab.2 Effect of proportion of soybean milk powder and milk powder on soybean milk yogurt quality

豆?jié){中蛋白質(zhì)種類與牛奶不同,因此豆?jié){和脫脂奶的添加比例會影響奶液中可溶性固形物含量和蛋白含量,由表2可以看出,隨著豆?jié){和脫脂奶的添加比例增大,牛奶蛋白質(zhì)含量逐漸增加,酸豆奶的凝乳效果越來越好,持水力處于遞增的趨勢,酸度逐漸降低.由表2可以看出,當(dāng)豆?jié){與脫脂奶的比例為3∶8時,其持水力較好,酸度適中,感官評分較好,所以確定豆?jié){的添加比例為2/11,3/11,4/11作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的參數(shù).

2.1.3 香菇發(fā)酵液添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響

確定豆?jié){和脫脂奶比例為3∶8,蔗糖添加量為6%,發(fā)酵劑添加量為0.10%,考察香菇發(fā)酵液添加量分別為0,15%,20%,25%,30%時,發(fā)酵液添加量對酸豆奶的品質(zhì)的影響,其測定結(jié)果見表3.

表3 發(fā)酵液添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響Tab.3 Effect of addition of fermentation broth on soybean milk yogurt quality

香菇發(fā)酵液對酸豆奶品質(zhì)有很大影響,可影響其凝乳時間,乳清析出量以及組織狀態(tài)和口感.一定范圍內(nèi)的香菇發(fā)酵液對酸豆奶的感官評分和持水力具有明顯的提高作用.由表3以看出,當(dāng)香菇發(fā)酵液添加量為15%,20%,25%時,香菇酸豆奶感官評價和持水力都較好,當(dāng)添加量達(dá)到30%時,酸豆奶質(zhì)量下降較明顯,因此應(yīng)控制好香菇發(fā)酵液的添加量.選擇15%,20%和25%作為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化范圍.

2.1.4 明膠添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響

確定豆?jié){和脫脂奶添加比例為3∶8,發(fā)酵劑添加量為0.1%,蔗糖添加量為6%,考察明膠添加量分別為0%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%,0.30%時,明膠添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響,其結(jié)果見表4.

添加一定量的穩(wěn)定劑或增稠劑,可以提高酸豆奶的黏稠度并改善其質(zhì)地狀態(tài)與口感,防止成品乳清析出,改善酸豆奶的品質(zhì).由表4可以看出,當(dāng)明膠添加量為0.10% ～0.20%時,明膠對酸豆奶作用效果良好;當(dāng)明膠用量超過0.20%時,產(chǎn)品色澤變暗,黏度有所下降,所以選擇 0.01%,0.15%和0.20%作為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化范圍.

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)以及單因素方差分析,確定豆?jié){添加量、香菇發(fā)酵液添加量和明膠添加量作為試驗(yàn)考察因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理,設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),各因素水平及編碼見表5.以感官評分和持水力為響應(yīng)值,建立數(shù)學(xué)模型,進(jìn)行方差分析,確立香菇酸豆奶的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件.響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表6.

表4 明膠添加量對酸豆奶品質(zhì)的影響Tab.4 Effect of addition of gelatin on soybean milk yogurt quality

表5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計因素水平及編碼Tab.5 Variables and their levels of response surface design

表6 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab.6 Experiment design and results of response surface method

2.2.1 感官評分方差分析

利用Design Expert軟件對表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到感官評分的實(shí)測值對編碼自變量A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程,擬合后得回歸方程為:

感官評分方差分析結(jié)果見表7.

通過表7可以看出,方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯,該模型回歸顯著(P＜0.05),失擬項(xiàng)不顯著,R2=87.44%,RAdj=71.28%,說明該模型與試驗(yàn)擬合良好,可用來進(jìn)行理論響應(yīng)值的預(yù)測.由表7還可看出,一次項(xiàng)中各因素對酸豆奶感官評分的影響從大到小依次為:豆?jié){添加比例＞發(fā)酵劑添加量＞明膠添加量.

2.2.2 持水力方差分析

利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到持水力的實(shí)測值對編碼自變量A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程,擬合后得回歸方程為:

持水力方差分析結(jié)果見表8.由表8可知:建立的數(shù)學(xué)模型的P值小于0.000 1,說明該數(shù)學(xué)模型極顯著,失擬項(xiàng)不顯著,R2=99.19%,RAdj=98.16%表明該模型可以很好的擬合試驗(yàn)的真實(shí)情況,可以用來預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果.由表8還可看出,一次項(xiàng)中各因素對酸豆奶持水力的影響從大到小依次為:明膠添加量 ＞豆?jié){添加量＞發(fā)酵劑添加量.

2.2.3 響應(yīng)曲面圖的分析及優(yōu)化工藝條件的確定

各因素響應(yīng)曲面圖見圖1.根據(jù)圖1中的響應(yīng)曲面圖,可以看到,當(dāng)香菇發(fā)酵液添加量固定時,香菇酸豆奶中的感官評分和持水力均隨著豆?jié){添加量的增加而升高,但豆?jié){添加量過大時,香菇酸豆奶的感官評分和持水力均減少,說明香菇發(fā)酵液添加量與豆?jié){添加量之間的交互作用明顯;豆?jié){添加量與明膠添加量也呈現(xiàn)出相同的趨勢.

香菇酸豆奶的感官評分和持水力的響應(yīng)面趨勢呈拋物線型,因此回歸方程具有極大值.結(jié)合方程與響應(yīng)曲面可得到香菇酸豆奶制作工藝的優(yōu)化參數(shù)為香菇發(fā)酵液添加量為20.15%,豆奶和脫脂奶以3∶8混合,明膠添加量為 0.17%,發(fā)酵劑添加量0.1%,蔗糖添加量為6%,產(chǎn)品色澤均一、組織細(xì)膩、酸甜爽口、營養(yǎng)豐富.

表8 持水力方差分析Tab.8 Analysis of variance of water holding capacity

圖1 各因素對酸豆奶品質(zhì)的交互影響的響應(yīng)曲面Fig.1 Response surface plots for effects of pairwise interactions among various variables on soybean milk yogurt quality

2.3 酸豆奶樣品的品質(zhì)測定

2.3.1 酸豆奶的感官評分

酸豆奶的感官質(zhì)量是影響產(chǎn)品銷售的重要因素,也能側(cè)面反映產(chǎn)品的內(nèi)部質(zhì)量.根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)得到優(yōu)化方案,其配方見表9.選擇前5個作為試驗(yàn)樣品,進(jìn)行感官評定和理化指標(biāo)測定.感官評分結(jié)果見表10.

表9 香菇酸豆奶的配方Tab.9 Recipe of Lentinus edodes soybean milk yogurt

酸奶的感官質(zhì)量是影響酸奶產(chǎn)品銷售的重要因素,也能側(cè)面反映產(chǎn)品的內(nèi)部質(zhì)量.處理組酸奶感官鑒定平均總得分25.19,對照酸奶總得分23.82.由此可知,香菇發(fā)酵液的添加使酸奶的感官性狀得到了提升.可以推測香菇酸奶更能滿足消費(fèi)者對食品的感官享受,在產(chǎn)品銷售過程中將占據(jù)優(yōu)勢.

2.3.2 酸豆奶中乳酸菌菌數(shù)和持水力

酸豆奶中乳酸菌菌數(shù)和持水力情況見圖2.

酸奶中的乳酸菌數(shù)是反映該產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一.乳酸乳衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 19302—2003)規(guī)定酸乳中乳酸菌數(shù)≥106CFU/g.由圖2可看出,添加香菇發(fā)酵液的酸豆奶中乳酸菌平均含量達(dá)到8.5×108CFU/mL,而未添加發(fā)酵液的對照酸豆奶中乳酸菌數(shù)僅有2.4×108CFU/mL,處理組是對照組的3.5倍.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,香菇發(fā)酵液對酸豆奶發(fā)酵過程中乳酸菌的生長有促進(jìn)作用.這是因?yàn)?香菇發(fā)酵液中不僅含有真菌多糖,還有乳酸菌生長所需的氨基酸、肽類、核苷酸和維生素等小分子化合物,是已知的酸奶發(fā)酵劑菌種的促生長因子;另外,大豆蛋白水解為大豆多肽后,對酸豆奶中的乳酸菌有促進(jìn)作用.

持水力越高說明凝膠體系穩(wěn)定性越高,產(chǎn)品的組織形態(tài)越好.從圖2可看出,添加香菇發(fā)酵液的酸豆奶的持水力為35.93%,略高于對照酸豆奶的32.29%,因而香菇酸豆奶的穩(wěn)定性較好.這是由于添加的香菇發(fā)酵液中含有大量的真菌多糖,電子掃描顯微技術(shù)研究表明,菌體細(xì)胞通過絲狀的多糖與周圍的蛋白質(zhì)凝塊相連形成復(fù)雜而穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成有利于改善發(fā)酵乳的流變特性,減少酸豆奶乳清析出[16].

2.3.3 酸豆奶的蛋白質(zhì)和氨基酸含量

酸豆奶的蛋白質(zhì)和氨基酸含量情況見圖3.

圖2 酸豆奶中的乳酸菌含量和持水力情況Fig.2 Amounts of lactic acid bacteria and water holding capacity in various soybean milk yogurt

酸豆奶在發(fā)酵過程中,其蛋白質(zhì)在蛋白酶和肽酶的作用下,可以降解為小分子肽和氨基酸[17].酸豆奶發(fā)酵過程中水解蛋白產(chǎn)生的小分子肽和氨基酸具有重要生理活性.由圖3可以看出,實(shí)驗(yàn)處理組蛋白質(zhì)含量平均值達(dá)到26.14 mg/mL,其氨基酸含量均值達(dá)到24.04 mmol/L;空白對照組蛋白質(zhì)含量為34.21 mg/mL,氨基酸含量為20.38 mmol/L,添加香菇發(fā)酵液的酸豆奶中的蛋白質(zhì)含量比對照組降低了31%,氨基酸含量提高了18%,說明香菇發(fā)酵液可以促進(jìn)酸豆奶中蛋白質(zhì)的降解,從而提高酸豆奶中氨基酸含量.這是因?yàn)樘砑拥南愎桨l(fā)酵液中含有一些氨基酸,而且加入發(fā)酵液后,促進(jìn)乳酸菌的繁殖,使得蛋白酶分泌增加,從而使蛋白質(zhì)降解程度更高,氨基酸含量增加,更有利于人體的吸收.

2.3.4 酸豆奶中風(fēng)味物質(zhì)的含量

酸豆奶中風(fēng)味物質(zhì)的含量情況見圖4.

圖3 各樣品酸豆奶中蛋白質(zhì)和氨基酸含量情況Fig.3 Contents of protein and amino acid in various soybean milk yogurt

圖4 酸豆奶中丁二酮和乙醛含量情況Fig.4 Contents of butanedione and acetaldehyde in various soybean milk yogurt

乙醛和丁二酮一直被認(rèn)為是構(gòu)成酸奶風(fēng)味的主要成分,其濃度和比例關(guān)系對于酸奶風(fēng)味有顯著的影響.乙醛是酸奶風(fēng)味的重要成分,一般認(rèn)為乙醛最佳風(fēng)味值為20～40 mg/L.嗜熱鏈球菌及保加利亞桿菌可產(chǎn)生微量丁二酮,酸奶中丁二酮的質(zhì)量濃度一般為8～15 mg/L[18].由圖4可以看出,添加香菇發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組酸豆奶中乙醛和丁二酮含量的均高于對照組酸豆奶,實(shí)驗(yàn)組乙醛平均濃度34.28 mg/L,丁二酮平均濃度14.88 mg/L;對照酸豆奶乙醛32.8 mg/L,丁二酮13.76 mg/L,較對照組分別提高了6.2%和7.3%.由此可見,添加香菇發(fā)酵液在一定程度上能促進(jìn)酸豆奶中風(fēng)味物質(zhì)的生成,從而使酸豆奶的風(fēng)味更佳.

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)各因素的水平范圍,以感官評分和持水力為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),建立響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型,依此模型進(jìn)行完全二次回歸分析,可得到香菇酸豆奶的優(yōu)化工藝為:香菇發(fā)酵液添加量為20.15%,豆?jié){添加比例為3/11,脫脂奶添加比例為8/11,明膠添加量為0.17%,蔗糖添加量為6%,發(fā)酵劑添加量 0.1%,42℃發(fā)酵5 h.

香菇酸豆奶中的乳酸菌含量較高,持水力略高于對照酸豆奶,穩(wěn)定性較好;產(chǎn)品蛋白降解更充分,氨基酸含量較高,乙醛和丁二酮含量略高于對照組.

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