王瑩瑩，付小寶，于 聰，李 冰，王雪瑩，郝景鋒

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132101）

隨著在防疫與治療上對(duì)抗生素的依賴(lài)性逐漸增大，耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題接踵而至，大腸桿菌又屬于多血清型和變異性強(qiáng)的細(xì)菌，極易產(chǎn)生耐藥性[1-2]。中草藥以其抗菌消炎、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)毒（低毒）、無(wú)殘留（低殘留）等特點(diǎn)脫穎而出[3]。試驗(yàn)選用6味中草藥及其配伍方劑提取物對(duì)3株大腸桿菌進(jìn)行了體外抑菌實(shí)驗(yàn)，以期為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）、大腸桿菌3（O44∶K74），來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)基：普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、ss瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁肉湯培養(yǎng)基（加微量酚紅）。單味藥物：板藍(lán)根、黃連、魚(yú)腥草、金銀花、蒲公英、大青葉。配伍方劑：方劑一由黃連、魚(yú)腥草、蒲公英組成；方劑二由板藍(lán)根、黃連、魚(yú)腥草、金銀花、蒲公英、大青葉組成；方劑三由金銀花、板藍(lán)根、魚(yú)腥草、黃連、大青葉組成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液制備

每味中草藥均按照水提法進(jìn)行煎煮，加熱至沸后改用文火保持30 min，用紗布過(guò)濾，重復(fù)2 次，合并3次濾液，濃縮至含生藥1g·mL-1，1000 rpm離心15 min，取上清液置于試管中備用，按照配伍方劑要求，分別取等量藥液，配出3個(gè)配伍方劑，置于試管中，調(diào)pH 至7.4～7.6，100℃滅菌10 min后，4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、ss瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁肉湯培養(yǎng)基（加入微量酚紅），均按照常規(guī)方法配制，調(diào)pH至7.2～7.6，高壓滅菌，制成平板培養(yǎng)基（除肉湯培養(yǎng)基外），冷卻后置于無(wú)菌室備用。

1.2.3 菌液制備

從分離菌株試管的斜面上挑取2～3接種環(huán)的細(xì)菌分別接種于SS 瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～18 h后，觀察大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上挑取乳白色的單個(gè)菌落，接種于5 mL 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24～36 h，取0.5 mL 于普通瓊脂平板上培養(yǎng)8～12 h，用滅菌生理鹽水洗下菌落并稀釋?zhuān)笥闷矫髢A注法估測(cè)活菌數(shù)后稀釋至1.0×109cfu·mL-1，即為試驗(yàn)菌液。

1.2.4 最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入改良馬丁肉湯培養(yǎng)基1 mL，依次編號(hào)，在第1管內(nèi)加入藥液1 mL，混勻后吸取1 mL，至第2管，依次類(lèi)推至第9管棄去1 mL，然后于每管中加入改良的馬丁肉湯培養(yǎng)基0.1 mL作103稀釋?zhuān)s含1.0×105cfu·mL-1）的菌液，第10 管作為陽(yáng)性對(duì)照，第11 管作為陰性對(duì)照。第1管至第9管藥物濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9 mg·mL-1，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。以培養(yǎng)物透明、不顯紅色的藥物濃度為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。從該試管中取培養(yǎng)物0.01 mL 接種到普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，以菌落數(shù)＜3個(gè)視為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度作為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。

2 試驗(yàn)結(jié)果

6 味中草藥及其配伍方劑對(duì)3 種血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見(jiàn)附表。

附表 6味中草藥及配伍方劑對(duì)3種大腸桿菌的MIC和MBC mg

由附表可以看出，單味黃連和方劑三的MIC值最小，表明黃連和方劑三對(duì)所選用的大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）和大腸桿菌3（O44∶K74）抑菌效果較明顯。

3 討 論

3.1 發(fā)病原因

大腸桿菌病主要發(fā)生于密集化養(yǎng)禽場(chǎng)，各種禽類(lèi)不分品種性別、日齡均對(duì)本菌易感。幼齡禽類(lèi)發(fā)病最多，污穢、擁擠、潮濕、通風(fēng)不良的環(huán)境，過(guò)冷過(guò)熱或溫差很大的氣候，有毒有害氣體（氨氣或硫化氫等）長(zhǎng)期存在，飼養(yǎng)管理失調(diào)，營(yíng)養(yǎng)不良（特別是維生素的缺乏）以及病原微生物（如支原體及病毒）感染所造成的應(yīng)激等均可導(dǎo)致本病的發(fā)生[5-6]。

3.2 耐藥性分析

大腸桿菌病已經(jīng)成為威脅畜禽業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性疾病之一。大腸桿菌的血清型較多，具有地域差異性，在防治上多采用抗生素治療，但由于其極易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等現(xiàn)象，因此急需另一種治療方式進(jìn)行優(yōu)化，而中草藥治療以其抗菌、消炎、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)脫穎而出。劉麗艷以白頭翁、黃連、板蘭根、大青葉、甘草等藥物為主組成的中草藥組方按0.5%～1%比例拌料或加入飲水中，結(jié)果表明，在感染的不同時(shí)期，用中草藥防治大腸桿菌病，預(yù)防組保護(hù)率在94%，比對(duì)照組高14%；治療組在感染的不同時(shí)期用藥，其最高保護(hù)率有很大差異，平均保護(hù)率達(dá)90.67%，比對(duì)照組高8.67%；對(duì)蛋種雞的預(yù)防性試驗(yàn)表明，發(fā)病率與病死率均較低，分別為1.8%、11.1%，比對(duì)照組低2.7%、13.3%；治療組最高保護(hù)率達(dá)90%，比對(duì)照組高7%。有效率達(dá)100%，比對(duì)照組高10%，對(duì)三黃肉雞治愈率達(dá)94%，比對(duì)照組高8%[7]。潘樹(shù)橋等針對(duì)性地選取對(duì)本地區(qū)大腸埃希氏菌有抑菌作用的中藥組成黃芩散經(jīng)對(duì)人工感染雞和現(xiàn)地應(yīng)用，結(jié)果表明，用于防治肉用仔豬大腸桿菌病具有良好的效果，總保護(hù)率達(dá)93.0%[8]。

3.3 藥敏試驗(yàn)分析

在特定環(huán)境下孵育24 h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度即最小抑菌濃度，用于定量測(cè)定體外抗菌活性[9]。李淑梅等選用黃連、黃芩、梔子、石榴皮、大黃5味中草藥，采用煎煮法提取有效成分，并對(duì)這5味中藥提取物在體外對(duì)致病性大腸桿菌的抑菌效果進(jìn)行了測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同中藥提取物在不同濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌有不同的抑制作用，黃連、黃芩對(duì)試驗(yàn)菌株的抑菌作用最強(qiáng)，而其他3 味藥物在高濃度時(shí)有效，低濃度時(shí)無(wú)效；黃連、黃芩、大黃3味藥物組合能增加抑菌效果，黃連、黃芩和梔子組合也能加強(qiáng)抑菌效果，而在配方中加入石榴皮的抑菌效果增加不顯著（P＜0.05）[10]。劉玉慶等用平板法、管碟稀釋法檢測(cè)大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、芽胞桿菌對(duì)23種單味中藥、復(fù)方清熱解毒類(lèi)中藥的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩、秦皮、黃連、大黃、連翹、金銀花、夏枯草、石榴皮等具有清熱解毒、瀉火燥濕功用的藥物抑菌效果較好，以三黃湯為基礎(chǔ)方的清熱解毒類(lèi)復(fù)方中草藥抑菌作用好，對(duì)大腸桿菌的MIC為125～500 mg·mL-1，復(fù)方中草藥比單味MIC高[11]。

本試驗(yàn)利用二倍稀釋法測(cè)定各血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入指示劑而鑒定抑菌情況。若培養(yǎng)基不變紅色時(shí)，說(shuō)明無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或僅有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，這樣便可以更直觀的判斷結(jié)果。由于每種中草藥及各配伍方劑的藥性與抑菌作用各不相同，因此對(duì)3株大腸桿菌的抑菌程度不同，因此各自的最小抑菌濃度也各有區(qū)別。由于黃連對(duì)該菌的抑制作用較強(qiáng)，因此黃連的MIC最小，而方劑三的MIC次之。單味中藥抑菌作用較好，但方劑也有其優(yōu)勢(shì)。方劑不僅可以抑菌，同時(shí)還有調(diào)理動(dòng)物機(jī)體的作用，從而增強(qiáng)其抵抗力。試驗(yàn)結(jié)果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍(lán)根、魚(yú)腥草、黃連、大青葉組成的方劑三對(duì)大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍(lán)根、魚(yú)腥草、黃連、大青葉組成的組方對(duì)大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

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