柏 錫，吳芳芳，林凡敏，趙曉雯，狄少康，朱延明，李 勇，才 華，紀(jì) 巍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

目前，我國鹽土面積約2 800萬hm2，全國有600萬hm2次生鹽漬化面積且逐年增加[1]。我國耕地面積急劇減少，鹽堿地的利用對解決糧食問題具有巨大潛力。鹽堿地的開發(fā)利用有多種途徑，培育和種植耐鹽作物品種是經(jīng)濟有效的方法之一。

大豆是重要的糧食作物、油料作物和工業(yè)原料，是中度耐鹽植物，受鹽漬條件影響顯著[2]，在鹽漬條件下產(chǎn)量下降明顯，而鹽敏感品種較耐鹽品種受鹽脅迫影響大。提高大豆的耐鹽性方法很多，通過植物基因工程技術(shù)培育耐鹽大豆新品種，是當(dāng)前國際上的熱門研究課題。建立便捷、穩(wěn)定的大豆耐鹽性鑒定體系，是耐鹽大豆種植推廣和轉(zhuǎn)基因大豆高效篩選的必要前提。本研究采用沙土水溶液的培養(yǎng)方法，選取本實驗室轉(zhuǎn)基因育種中3個主要受體品種綏農(nóng)28、合豐50和合豐55為材料，分別在種子發(fā)芽期（VE期）、第二片三出復(fù)葉長出時期（V2期）進行不同濃度NaCl處理，測定多項生理指標(biāo)，建立3個大豆品種的耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆篩選體系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇東北地區(qū)主栽大豆品種綏農(nóng)28（SN28）、合豐50（HF50）和合豐55（HF55）為材料，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 VE期大豆發(fā)芽率的測定

精選籽粒飽滿、種皮完整、大小均勻的種子，采用氯氣滅菌的方法[4]，滅菌12～14 h，將滅菌的種子擺放在經(jīng)高溫消毒（180℃×2 h）后的砂床里，該沙床以12 cm×2 cm的培養(yǎng)皿為容器，內(nèi)為20目的石英砂。用滅過菌的NaCl溶液進行鹽脅迫處理，NaCl處理濃度分別為0、100、150、200、250 mmol·L－1，每個處理使用30粒大豆，并重復(fù)3次。于（25±1）℃、光周期18 h/6 h的光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。處理后第7天測定發(fā)芽率。

1.2.2 V2期耐鹽性的測定

種子用5%NaClO溶液消毒2～3 min，用自來水沖洗后再用蒸餾水浸泡4～5 h[4]，待種子充分吸水膨脹后，將其播種于盛有砂性土（細(xì)沙∶草炭土=7∶3）的育苗盤中。培養(yǎng)時將育苗盤放入盛有20 L蒸餾水的20 cm×80 cm白缽中，并保持砂性土2/3高度處于水面下。每天向白缽中補入一定量的蒸餾水，以維持水面高度。待幼苗長至V2期，將白缽中的蒸餾水換成不同濃度的NaCl溶液。NaCl處理濃度分別為 0、100、150、200 mmol·L－1，電導(dǎo)率分別維持在800 μs·cm－1、11～12、15～16、20～21 ms·cm－1。每個處理含30粒大豆種子，并重復(fù)3次。處理時間約為5～8 d。

1.3 各項生理指標(biāo)的測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽率

發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根伸出種臍部分長度超過種子縱徑一半為標(biāo)準(zhǔn)，要求胚根發(fā)育正常，但胚根彎曲并呈螺旋狀盤繞者不予統(tǒng)計。

1.3.2 死亡葉面積率

死亡葉面積率（%）=死亡葉片個數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100%。

統(tǒng)計時以干枯部分占葉片面積的比例來計算（例如只有一半葉片干枯即為1/2個葉片）。

1.3.3 相對株高鹽害率

相對株高鹽害率（%）=（對照植株平均株高－處理后植株的平均株高）/對照植株平均株高×100%；

株高為幼苗莖與沙土接觸面到最新的生長點之間的距離。

1.3.4 相對電導(dǎo)率

取植株第一片三出復(fù)葉，保證樣品的一致性。用打孔器打9個葉盤浸入20 mL ddH2O中，10 h后用DDS－11A型電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，記為R1。沸水浴上加熱30 min，冷卻后測定電導(dǎo)率，記為R2。相對電導(dǎo)率（%）=R1/R2×100%。

1.3.5 丙二醛含量

稱取植物材料0.5～1 g放入研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入4 mL 5%TCA，5 000 r·min－1離心10 min。吸取離心的上清液2 mL（對照加2 mL蒸餾水），加入2 mL 0.6%TBA溶液，搖勻。將離心管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時），取出試管并冷卻，3 000 r·min－1離心15 min，以0.6%TBA 溶液為空白對照測定在532、600和450 nm波長下的吸光度值。

MDA濃度（μmol·L－1）=6.45 ×（D532－D600）－0.56×D450。

MDA 含量（μmol·g－1）=MDA濃度（μmol·L－1）×提取液體積（mL）×10－3/樣品重量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl對種子發(fā)芽率的影響

鹽分可從如下兩個方面影響種子的發(fā)芽率：一是建立滲透勢阻止水分吸收，二是離子毒害。鹽分脅迫降低種子儲藏物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化速率，也造成活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)動態(tài)平衡的破壞，啟動膜脂過氧化或脫脂作用，損傷膜脂和膜蛋白，從而抑制種子發(fā)芽。不同濃度NaCl處理下大豆的發(fā)芽率見圖1、2（圖1彩版見封三）。隨著NaCl濃度的增高，3個品種種子發(fā)芽率均在逐漸減小，說明該方法能夠保證處理條件的穩(wěn)定，從而準(zhǔn)確地區(qū)分不同濃度NaCl對大豆的傷害。綏農(nóng)28、合豐55和合豐50這3個品種分別在150、200和150 mmol·L－1的NaCl濃度下50%的種子發(fā)芽率被抑制。在相同NaCl濃度處理下，3個品種表現(xiàn)出不同的種子發(fā)芽能力：合豐55＞綏農(nóng)28＞合豐50。這說明種子發(fā)芽率可以作為這3個品種耐鹽性的一個篩選標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 不同濃度NaCl對大豆發(fā)芽的影響Fig.1 Effect of different concertration NaCl on germination of soybean

圖2 鹽脅迫下種子發(fā)芽率的變化Fig.2 Change of germination rate of soybean under salt stress

2.2 不同濃度NaCl對死亡葉面積率的影響

葉片對生境條件的反應(yīng)最為敏感。鹽脅迫開始時造成植物葉片失綠、葉片生長速率降低，隨著鹽害的增強，葉片停止生長，葉面積不再增加，葉尖葉緣焦黃，葉柄變軟并逐漸死亡[10]。所以，死亡葉面積率是衡量鹽害程度的一個重要指標(biāo)。

本研究觀察了3個大豆品種在不同NaCl濃度下的死亡葉面積率（見圖3，此圖彩版見封三），并進行統(tǒng)計分析，從顯著性分析中可以看出，合豐50、合豐55、綏農(nóng)28分別在200、150、100 mmol·L－1的NaCl處理下死亡葉面積率與對照之間存在顯著性差異，因此，選擇這3個濃度為大量轉(zhuǎn)基因大豆進行耐鹽性分析時所取的處理濃度。通過統(tǒng)計分析，在最大處理濃度200 mmol·L－1NaCl條件下，3個品種死亡葉面積率表現(xiàn)為合豐55＞合豐50＞綏農(nóng)28，死亡葉面積率可作為大豆耐鹽性的一個篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 不同濃度NaCl對相對株高的影響

過量鹽分對植物造成滲透脅迫，從而干擾營養(yǎng)離子平衡，鹽分通過抑制和誘導(dǎo)多種酶系統(tǒng)來影響植物的正常生長[11]。生物量是植物對鹽脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，也是植物耐鹽性的直接指標(biāo)之一。

不同濃度NaCl下的相對株高鹽害率見圖4。可以看出隨著NaCl濃度的增高，大豆株高受到的抑制越嚴(yán)重。在4個處理濃度下，合豐55相對株高減小幅度最大，其次是綏農(nóng)28，最小的是合豐50。該結(jié)果同樣顯示出合豐55耐鹽能力最差。相對株高可以作為大豆耐鹽性的一個篩選標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 不同濃度NaCl對大豆苗期死亡葉面積率的影響Fig.3 Effect of different NaCl concentrations on soybean leaf mortality

圖4 鹽脅迫下相對株高的變化Fig.4 Change of relative height under salt stress

2.4 不同濃度NaCl對相對電導(dǎo)率的影響

在植物抗逆研究中，細(xì)胞膜透性變化已成為一個公認(rèn)的指標(biāo)。一般認(rèn)為耐鹽能力強的品種在鹽脅迫下，細(xì)胞膜透性變化較小，敏感品種則變化較大[12]。Mckay指出可以用相對電導(dǎo)率來表示細(xì)胞膜透性的大小，它可以反映植物細(xì)胞膜在各種逆境條件下的細(xì)胞膜受損程度[3]。

圖5 鹽脅迫下相對電導(dǎo)率的變化Fig.5 Change of relative electricity conductivity under salt stress

圖5列出了不同濃度NaCl處理下的相對電導(dǎo)率，可以看出隨著NaCl濃度的增高，葉片相對電導(dǎo)率不斷增大。統(tǒng)計分析表明在各個品種中各處理和對照之間都存在著顯著差異。結(jié)果顯示在鹽脅迫下合豐55質(zhì)膜受到的損害最大，其次是合豐50，最小的是綏農(nóng)28。該結(jié)果與死亡葉面積率的分析結(jié)果一致。相對電導(dǎo)率可以作為大豆耐鹽性的一個篩選指標(biāo)。

2.5 不同濃度NaCl對丙二醛含量的影響

由圖6可知，隨著NaCl濃度的增高，丙二醛含量也在增高，說明受到的鹽害程度在增大?？傮w上3個品種間受傷害的程度為：合豐55＞合豐50＞綏農(nóng)28。合豐50、合豐55、綏農(nóng)28分別在200、150、100 mmol·L－1NaCl處理下的丙二醛含量將作為這3個品種耐鹽性的一個篩選標(biāo)準(zhǔn)。該結(jié)果也與死亡葉面積率等結(jié)果一致，同時，從圖中可以看出在4個處理濃度下3個品種的變化趨勢完全一致。因此，丙二醛含量將作為耐鹽性分析的一個理想指標(biāo)。

圖6 鹽脅迫下丙二醛含量的變化Fig.6 Change of MDA content under salt stress

2.6 耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的篩選

本研究應(yīng)用該耐鹽性鑒定體系，對已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)耐鹽基因GsGST14的合豐55的大豆進行耐鹽性分析，通過表型試驗和生理指標(biāo)的測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆比野生型大豆具有顯著的耐鹽能力。結(jié)果見圖7。

從圖7中可以看出，受到鹽脅迫后，與野生型（合豐55）相比轉(zhuǎn)基因植株的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量明顯較低，說明轉(zhuǎn)基因大豆植株受到的傷害遠遠小于非轉(zhuǎn)基因大豆；特別是表型數(shù)據(jù)相對株高的比較，可以看出，鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因大豆株高的影響微乎其微，而非轉(zhuǎn)基因大豆株高受到的影響是轉(zhuǎn)基因大豆的幾十倍，嚴(yán)重妨害大豆的正常生長和產(chǎn)量。以上結(jié)果表明，本文的鑒定體系非常適合于大豆耐鹽性鑒定和轉(zhuǎn)基因大豆的篩選。

圖7 轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性分析Fig.7 Analysis of salt tolerance in transgenic soybean under salt stress

3 討 論

鹽漬土壤是陸地上分布廣泛的一種土壤類型，選育具有較高耐鹽能力的大豆，對增加糧油需求，改善土壤結(jié)構(gòu)和有機質(zhì)含量，緩解土壤鹽漬化危害具有重要意義。大豆在各個生長階段對鹽脅迫的敏感程度不同，因此，對大豆各生長階段進行耐鹽性分析尤為必要。在大豆發(fā)芽期，本研究采用砂培法，整個培養(yǎng)過程中始終使種子處于無菌狀態(tài)，解決了以往砂培法培養(yǎng)過程中長菌以及用土壤培養(yǎng)法對鹽脅迫的緩沖作用。在本研究中采取沙土水溶液法對大豆苗期的耐鹽性進行分析，該方法采用疏松的沙土作為營養(yǎng)供給物，用水來傳輸營養(yǎng)物質(zhì)并維持不同植株處于相同的生長條件下，在培養(yǎng)過程中通過維持水位一致和電導(dǎo)率一致來保證培養(yǎng)條件的一致性，解決傳統(tǒng)水培法需要頻繁配制和更換營養(yǎng)液、易長霉菌、植株徒長和工作量大、土培法無法保證土壤環(huán)境均一、試驗結(jié)果重復(fù)性較差等問題。

本文采用改良砂培法和沙土水溶液法（結(jié)合砂培法和水培法并改進）分別對大豆發(fā)芽期與幼苗期的耐鹽性分析，結(jié)果表明，該方法能有效區(qū)分不同品種、不同鹽濃度下植株受鹽害程度，多個性狀和生理指標(biāo)間具有一致性，說明該方法適合于對大豆進行耐鹽性鑒定。隨著植物生物技術(shù)發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種已成為一種快速、有效的手段培育耐逆品種，對這些耐逆轉(zhuǎn)基因品種進行耐逆性分析，是進行推廣的前提條件。在本研究中，通過大豆苗期耐鹽性分析方法對前期獲得的轉(zhuǎn)基因大豆進行耐鹽性分析，發(fā)現(xiàn)該方法能明顯區(qū)分轉(zhuǎn)基因大豆和野生型的耐鹽能力，進一步證明該方法的可行性。

4 結(jié)論

本研究建立大豆耐鹽性鑒定體系，其中包括大豆種子發(fā)芽期和幼苗期。兩個階段分別采用改良的砂培法、沙土水溶液法，大豆發(fā)芽期選取抑制50%大豆萌發(fā)的濃度作為評價大豆種子萌發(fā)期耐鹽性的指標(biāo)；大豆幼苗期選取死亡葉面積率、相對株高作為形態(tài)指標(biāo)；相對電導(dǎo)率、丙二醛含量作為生理指標(biāo)；經(jīng)證明兩個方法簡單、有效、一致。

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