馬景蕃，黃素華，劉喜明，黎 英，周酵瓊

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學(xué)院資源工程學(xué)院，福建 龍巖 364012）

蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物細(xì)胞感受各種環(huán)境信號(hào)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大過(guò)程中起重要作用[1]，其中促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen－activated protein kinases，MAPKs）的作用受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MAPK參與激素應(yīng)答、環(huán)境脅迫反應(yīng)以及植物抗病反應(yīng)[2]。在植物抗病反應(yīng)調(diào)控方面，發(fā)現(xiàn)MAPK可以參與抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)、過(guò)敏性反應(yīng)中細(xì)胞死亡以及植物的先天性免疫反應(yīng)等[3]。例如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，使用MPK4特異性抗體進(jìn)行生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，各種各樣的生物和非生物脅迫都能夠誘導(dǎo)MPK4激活[4]。

植物防御與病原菌侵染是一個(gè)互動(dòng)過(guò)程，在此過(guò)程中植物針對(duì)病原菌不同的侵染方式會(huì)做出相應(yīng)特異的防衛(wèi)反應(yīng)[5]。研究表明水楊酸（Salicylic acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等植物激素也參與植物抗病、抗逆過(guò)程[6]，其中SA和JA是植物防衛(wèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的信號(hào)分子。由水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)是植物抵御病原菌的最重要方式。很多研究表明這兩種防衛(wèi)反應(yīng)方式存在明顯交叉和拮抗，一些植物主要通過(guò)茉莉酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)方式抵抗對(duì)非專(zhuān)性寄生性病原菌的侵染[7]。擬南芥MPK4是水楊酸和茉莉酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)基因，其功能缺失突變體表現(xiàn)出對(duì)壞死型病原菌高度敏感，表明該基因在抗壞死型病原菌中起作用[8]，但至今為止，還沒(méi)有關(guān)于這些病害防御信號(hào)分子與不結(jié)球白菜MPK4基因表達(dá)之間關(guān)系的報(bào)道。

不結(jié)球白菜（Brassica campestrisssp.chinensisMakino）原產(chǎn)于中國(guó)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，是長(zhǎng)江中下游地區(qū)主要蔬菜品種之一，但不結(jié)球白菜病害相當(dāng)嚴(yán)重，其中菌核病[Sclerotinia sclerotiorumde（Bary）]是最主要病害之一，常給菜農(nóng)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[9]。不結(jié)球白菜菌核病屬非專(zhuān)性寄生[10]，能產(chǎn)生壞死斑，而草酸是菌核病主要的致病因子。

本研究將采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究不結(jié)球白菜BcMPK4在核盤(pán)菌接種、核盤(pán)菌致病因子草酸處理、病害防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)分子SA、JA類(lèi)似物MeJA和植物激素ABA處理后的表達(dá)變化差異，期望了解菌核病及其致病因子草酸、防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)分子、植物激素ABA與BcMPK4表達(dá)的關(guān)系，為不結(jié)球白菜抗菌核病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為不結(jié)球白菜抗菌核病品種003－R－6和高感品種003－S－7，由龍巖學(xué)院生物技術(shù)課題組提供。將兩個(gè)品種的種子用0.1%HgCl2浸泡5 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25℃催芽24 h。然后將催芽后的種子播種于滅菌基質(zhì)中，于人工培養(yǎng)箱在白天25℃、夜晚15℃、12 h/12 h光周期條件下培養(yǎng)，待幼苗培育至四葉一心時(shí)用于試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 菌核病的接種

核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）菌核采自龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)的不結(jié)球白菜莖稈。選好菌核后，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%HgCl2消毒10 min，再用無(wú)菌水沖洗4次，把滅菌菌核切去兩端，中間部分切成綠豆大小，切面朝下，接種于PDA（Potato dextrose agar）培養(yǎng)基。在25℃下暗培養(yǎng)4 d，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，用打孔器將菌絲截成直徑為0.4 cm大小的菌絲瓊脂塊，用于接種。待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)對(duì)第三葉進(jìn)行菌核病菌接種處理，接種前5 d將植株22℃恒溫培養(yǎng)，選用核盤(pán)菌的菌絲塊進(jìn)行活體接種，對(duì)照接種無(wú)菌培養(yǎng)基塊。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 化學(xué)誘導(dǎo)處理

草酸（Oxalic acid，OA），分析純，購(gòu)自同濟(jì)大學(xué)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；水楊酸、甲基茉莉酸（Methyl jasmonate，MeJA）和脫落酸購(gòu)自Sigma公司。

當(dāng)不結(jié)球白菜幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，處理前5 d將植株進(jìn)行22℃恒溫培養(yǎng)。分別用5 mmol·L－1草酸（OA）、0.1 mmol·L－1水楊酸（SA）[11]、0.1 mmol·L－1甲基茉莉酸（MeJA）、0.1 mmol·L－1脫落酸（ABA）[12]噴霧四葉期植株的第三片真葉，滅菌雙蒸水噴霧處理相同苗齡的相應(yīng)葉片為對(duì)照。噴霧至葉片上均勻布滿(mǎn)液滴為止。每種處理20株，3次重復(fù)。將各種不同處理的植株分別放入不同的密封間，22℃恒溫保濕培養(yǎng)。

1.2.3 取樣

上述核盤(pán)菌及不同化學(xué)試劑處理不結(jié)球白菜抗感品種后，分別在0、4、8、16、24、48、72 h剪下處理葉片（包括對(duì)照葉片），用錫箔紙包裹，迅速置于液氮中，8 min后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。

1.2.4 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

不結(jié)球白菜葉片總RNA提取參考Ma等方法進(jìn)行[13]，所用玻璃和塑料制品均經(jīng)0.1%DEPC浸泡過(guò)夜，高溫高壓滅菌處理。利用TaKaRa公司寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primescript 1st strand cDNA synthesis kit）合成第一鏈cDNA。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)定量PCR方法參照SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（TaKaRa），以不結(jié)球白菜3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（BcGAPDH，DDBJ登錄號(hào)AB331373）作為內(nèi)標(biāo)基因，引物為：5'CTGTCT CGCTCCATTCG 3'和5'AGTTTCCCTTTGAGGTTAG 3'，BcMPK4基因引物序列為：5'GACACTGATC TCCACCAG 3'和 5'ATCCTATAAGCTCAGTGAT 3'。引物由金思特生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)在Rotor Gene 3000（Corberr Research公司）熒光梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為25 μL，熱啟動(dòng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，52℃退火20 s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；熔解曲線測(cè)定為從60℃到95℃，3次重復(fù)。數(shù)據(jù)由Opticon Monitor TM 1.02（MJ公司）軟件和Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核盤(pán)菌侵染后BcMPK4分別在抗、感病品種中表達(dá)的變化

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不結(jié)球白菜經(jīng)核盤(pán)菌誘導(dǎo)后BcMPK4基因的表達(dá)Fig.1 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by Sclerotinia sclerotiorum

擬南芥MPK4功能缺失突變體對(duì)非專(zhuān)化寄生性病原菌Alternaria brassicicola表現(xiàn)出增加感病性表型，并且伴隨防衛(wèi)素基因的表達(dá)降低[8]。為檢測(cè)不結(jié)球白菜BcMPK4基因是否在防衛(wèi)非專(zhuān)化寄生性病原菌Sclerotinia sclerotiorum的侵染中行使功能，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BcMPK4在不結(jié)球白菜抗感品種中被核盤(pán)菌侵染后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在抗性品種003－R－6中，當(dāng)核盤(pán)菌侵染4 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量迅速上升，與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)侵染8 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量上升至最高，約是對(duì)照的1.8倍，與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。之后BcMPK4表達(dá)量開(kāi)始下降，當(dāng)侵染24和48 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量顯著低于對(duì)照，當(dāng)侵染72 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量再次升高，與對(duì)照相比差異極顯著（P＜0.01）。而感病品種003－S－7接種核盤(pán)菌后，BcMPK4表達(dá)量與抗病品種迥然不同，感病品種均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，而且隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，BcMPK4表達(dá)量逐漸下降，當(dāng)侵染72 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量達(dá)最低，約為對(duì)照的0.22倍（見(jiàn)圖1）。

2.2 草酸誘導(dǎo)BcMPK4在抗、感病品種中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

草酸是一種包括核盤(pán)菌在內(nèi)的許多病原真菌分泌的植物毒素。為研究草酸與BcMPK4之間的關(guān)系，選用5 mmol·L－1草酸來(lái)處理不結(jié)球白菜抗感品種葉片，觀察這個(gè)基因在不同抗感品種中不同處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在品種003－R－6中，經(jīng)草酸誘導(dǎo)4 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量迅速上升，與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)誘導(dǎo)8 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量上升至最高，約是對(duì)照的1.7倍，與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。當(dāng)誘導(dǎo)24、48和72 h時(shí)表達(dá)量均下調(diào)，大約分別是對(duì)照的82%、67%和43%，與各自對(duì)照相比差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。而感病品種003－S－7經(jīng)草酸誘導(dǎo)后，BcMPK4表達(dá)量均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，而且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸下降，當(dāng)侵染72 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量達(dá)到最低，約為對(duì)照的16%（見(jiàn)圖2）。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不結(jié)球白菜經(jīng)草酸誘導(dǎo)后BcMPK4基因的表達(dá)Fig.2 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by oxalic acid

2.3 水楊酸誘導(dǎo)BcMPK4在抗、感病品種中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)后，在品種003－R－6中，BcMPK4表達(dá)總體呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)（見(jiàn)圖3）。誘導(dǎo)4 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量迅速上升，與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)誘導(dǎo)8 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量上升至最高，約是對(duì)照的1.8倍，與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。誘導(dǎo)16 h時(shí)，表達(dá)量開(kāi)始下降，誘導(dǎo)24 h時(shí)，表達(dá)量下降到對(duì)照的76%，到72 h下降至21%。表明在不結(jié)球白菜抗性品種中水楊酸可快速誘導(dǎo)MPK4上調(diào)表達(dá)。感病品種003－S－7經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)后，BcMPK4表達(dá)量均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸下降，當(dāng)侵染72 h時(shí)，BcMPK4表達(dá)量達(dá)到最低，約為對(duì)照的27%（見(jiàn)圖3）。

2.4 甲基茉莉酸誘導(dǎo)BcMPK4在抗、感病品種中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不結(jié)球白菜經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)后BcMPK4基因的表達(dá)Fig.3 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by salicylic acid

茉莉酸是植物防御反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號(hào)分子，而甲基茉莉酸（MeJA)是其功能類(lèi)似物。采用信號(hào)分子茉莉酸的類(lèi)似功能處理不結(jié)球白菜葉片，通過(guò)研究在不同處理時(shí)間點(diǎn)BcMPK4在不結(jié)球白菜體內(nèi)表達(dá)差異來(lái)探討該基因與茉莉酸的關(guān)系。如圖4所示，不結(jié)球白菜抗感兩個(gè)品種經(jīng)MeJA處理后，BcMPK4表達(dá)都被抑制，抗性品種于處理后4 hBcMPK4相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照的50%，但處理后8 h，其表達(dá)量逐漸上升，于處理后72 h表達(dá)量達(dá)最大，約為對(duì)照的84%?？梢?jiàn)處理8 h后，MeJA對(duì)不結(jié)球白菜BcMPK4表達(dá)抑制率逐漸下降。感病品種經(jīng)MeJA處理后4 h，BcMPK4相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照的27%，與抗性品種相比，抑制幅度更大。處理后8 h，其表達(dá)量逐漸上升，但與抗性品種相比，上升幅度更?。ㄒ?jiàn)圖4）。

2.5 ABA誘導(dǎo)BcMPK4在抗、感病品種中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

ABA等植物激素也參與植物抗病、抗逆過(guò)程[14]。經(jīng)ABA處理后，BcMPK4表達(dá)水平變化在抗感品種中各不相同，在抗性品種中，ABA處理對(duì)BcMPK4表達(dá)影響不大，在整個(gè)研究時(shí)間范圍內(nèi)，處理與對(duì)照的差異均未達(dá)顯著水平（P＜0.05）。而在感性品種中，于處理后4 h，表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降，經(jīng)處理后72 h，BcMPK4表達(dá)量達(dá)最低，約為對(duì)照的47%，表達(dá)差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）（見(jiàn)圖5）。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不結(jié)球白菜經(jīng)甲基茉莉酸誘導(dǎo)后BcMPK4基因的表達(dá)Fig.4 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by methyl jasmonate

圖5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不結(jié)球白菜經(jīng)脫落酸誘導(dǎo)后BcMPK4基因的表達(dá)Fig.5 qPCR analysis of relative expression levels of BcMPK4 induced by abscisic acid

3 討論

SIPK和WIPK是在煙草中發(fā)現(xiàn)的MAP激酶，其生物學(xué)功能說(shuō)明MAPK鏈參與抗性基因介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，即含有抗TMV的抗性基因—N基因的煙草植株，在與無(wú)毒菌株互作時(shí)，通過(guò)Ser/Thr和Tyr氨基酸位點(diǎn)的磷酸化可激活WIPK蛋白發(fā)揮作用。雖然很多抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)大多依賴(lài)SA存在，但WIPK的激活卻不依賴(lài)SA[15]，說(shuō)明這個(gè)蛋白在“基因?qū)颉保╣ene－for－gene）介導(dǎo)的抗病反應(yīng)中起作用。此外，Romeis等用來(lái)自病原菌無(wú)毒基因Avr9處理含有抗性基因Cf29的煙草懸浮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Cf29/Avr9的互作激活SIPK和WIPK兩種蛋白，推測(cè)MAP激酶可能位于抗性基因介導(dǎo)的信號(hào)傳遞鏈下游[3]。目前已知SA以及非特異激發(fā)子等都能激活SIPK和WIPK蛋白，說(shuō)明它們誘導(dǎo)的多個(gè)抗性基因信號(hào)途徑是通過(guò)SIPK或WIPK等MAPK鏈發(fā)揮作用。

本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，核盤(pán)菌侵染初期，不結(jié)球白菜抗性品種BcMPK4表達(dá)量迅速上升，而感性品種該基因表達(dá)量逐漸下降（見(jiàn)圖1），表明BcMPK4參與不結(jié)球白菜對(duì)核盤(pán)菌抗性反應(yīng)。草酸能夠誘導(dǎo)BcMPK4在不結(jié)球白菜抗性品種中表達(dá)，表現(xiàn)在經(jīng)草酸誘導(dǎo)初期BcMPK4在抗性品種中表達(dá)迅速上升（見(jiàn)圖2），由圖1和2可以看出，草酸與核盤(pán)菌誘導(dǎo)BcMPK4基因的表達(dá)在0～48 h內(nèi)是一致的，這個(gè)結(jié)果支持核盤(pán)菌在侵染植物時(shí)釋放草酸毒素是其重要致病機(jī)理。同時(shí)也說(shuō)明植物通過(guò)增加BcMPK4表達(dá)抵御侵染脅迫。但是與草酸不同，核盤(pán)菌是活性生物，可以持續(xù)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行侵染破壞，所以經(jīng)核盤(pán)菌處理后，在抗性品種中BcMPK4表達(dá)出現(xiàn)兩次高峰（見(jiàn)圖1），這種表達(dá)動(dòng)態(tài)可能暗示植物與核盤(pán)菌之間存在動(dòng)態(tài)相互作用。經(jīng)草酸和SA誘導(dǎo)后，BcMPK4表達(dá)在抗感品種中的變化趨勢(shì)是高度一致的。另外，在0～48 h，草酸、SA、核盤(pán)菌誘導(dǎo)BcMPK4表達(dá)反應(yīng)趨勢(shì)也一致。這說(shuō)明不結(jié)球白菜對(duì)SA、草酸以及核盤(pán)菌反應(yīng)機(jī)制的分子網(wǎng)絡(luò)中包含BcMPK4。

MeJA和SA誘導(dǎo)BcMPK4在抗性品種中的表達(dá)趨勢(shì)截然不同，特別是在誘導(dǎo)4 h的初期反應(yīng)中，SA和MeJA分別誘導(dǎo)BcMPK4上調(diào)和下調(diào)表達(dá)（見(jiàn)圖3、4）。因此BcMPK4在不結(jié)球白菜中可能調(diào)節(jié)SA介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。這與擬南芥中AtMPK4的研究結(jié)果是一致的[4]。經(jīng)ABA處理后BcMPK4表達(dá)水平在抗性品種中幾乎無(wú)變化（見(jiàn)圖5），說(shuō)明ABA不能介導(dǎo)BcMPK4在不結(jié)球白菜中的防衛(wèi)反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究不結(jié)球白菜BcMPK4在菌核病防衛(wèi)反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，核盤(pán)菌、OA和SA能快速誘導(dǎo)BcMPK4在抗性品種中表達(dá)，而MeJA抑制其表達(dá)，ABA對(duì)BcMPK4表達(dá)響應(yīng)不明顯，由此推測(cè)BcMPK4在核盤(pán)菌誘抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和SA信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。

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