梁 毅，劉雪瑩,2，李景富，徐啟江，張洪偉

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；2.東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；3.東北林業(yè)大學生命科學院，哈爾濱 150040）

MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中的序列特異同源異型基因。由保守程度不同的MADS-box、I、K和C結構組成[1]。通過對MADS-box基因家族的深入研究，在不同物種中克隆大量MADS-box基因，這些結果表明MADS-box基因在被子植物中的功能是保守的，大部分都參與花發(fā)育調控過程，并且在根、葉、胚珠及果實的發(fā)育中均起作用[2]。

近年來，植物花發(fā)育分子機制研究取得較大進展，其中雙子葉植物擬南芥、矮牽牛、金魚草的花同源異型突變體研究確定ABCDE模型[3-4]，初步揭開植物花發(fā)育的奧秘。該模型認為，A和E功能基因調控萼片發(fā)育，A、B和E功能基因調控花瓣發(fā)育，B、C和E功能基因調控雄蕊發(fā)育，C和E功能基因調控心皮發(fā)育，C、D和E功能基因調控胚珠發(fā)育，A和C功能基因相互拮抗。當A基因發(fā)生突變時，C基因表達便會擴展，導致萼片異化為心皮，花瓣變?yōu)樾廴?；B基因發(fā)生突變則會使花瓣變成萼片，雄蕊變成心皮；若C基因突變，則致使A基因表達擴展，雄蕊和心皮分別被花瓣和萼片代替。除APETALA2基因外，所有的花器官特征屬性基因均編碼MADS-box轉錄因子，具有典型的MIKC結構域模型[5-6]。研究表明，許多心皮型CMS系統中，B類MADS-box轉錄因子的表達量都趨于下降[7-8]；根據ABCDE模型，若A基因被擴展到雄蕊，同時C基因被限制在心皮，則可產生雄蕊瓣化型的突變體[9]。

胡蘿卜（Daucus carrot），又稱甘荀，是傘形科野生胡蘿卜變種的一、二年生異花授粉草本植物，栽培歷史在2 000年以上。胡蘿卜花是復傘形花序頂生、花極小、白色或淡粉色[10]。胡蘿卜雄性不育的花有別與野生型而出現雄蕊瓣化現象，為進一步探究胡蘿卜花發(fā)育有關機制，采用RACE原理，克隆胡蘿卜相關MADS-box基因的全長cDNA，為胡蘿卜采用基因工程進行輔助育種提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胡蘿卜品種由北京市農林科學院蔬菜研究中心洋蔥與胡蘿卜課題組提供。采集花蕾及成花的各部分器官萼片、心皮、雄蕊，以及營養(yǎng)器官根、莖、葉。采集后用錫箔紙包裝后放入液氮中，存于-80℃冰箱中，用于總RNA提取。

1.2 cDNA的合成和cDNA全長的獲得

RNA提取采用TRIZOL試劑盒，具體步驟參見操作手冊。以RNA為模板，利用引物5'GACTCGA GTGCACATCGA（T）173'合成cDNA的第一條鏈。進行3'-RACE時，以第一鏈cDNA為模板，利用MADS-box基因簡并引物AD、SP3分別與P18E配對進行PCR擴增，擴增片段經溶膠回收克隆到pGEM?-T載體（TaKaRa）。根據測序結果，設計引物GSP1、GSP2并進行巢式PCR，具體試驗步驟根據5'-full RACE kit（TaKaRa）試劑盒進行操作。獲得5'-序列后，將5'-與3'-序列進行拼接，從而獲得cDNA全長。試驗中使用的引物見表1。

1.3 胡蘿卜MADS-box基因表達RT-PCR分析

分別提取胡蘿卜的根、莖、葉、萼片、雄蕊、和心皮等器官的總RNA，選用cDNA合成試劑盒（TaKaRa），分別以各樣品總RNA為模板、Oligo（dt）20為引物合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板進行 RT-PCR?？傮w系為 25 μL，包括 2.5 μL 10×緩沖液（加Mg2+），2.0 μL dNTP上下游特異引物（2.0 mmoL·L-1）各0.8 μL，模板cDNA 1.0 μL，0.4 μL ExTaq酶（5 U·mL-1，TaKaRa），加滅菌蒸餾水至總體積25 μL。在反應液上覆蓋一薄層液體石蠟油，保證PCR反應時體系的穩(wěn)定性。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下進行檢測。使用肌動蛋白ACTIN作為內參，試驗中使用的引物見表1。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜MADS-box基因序列的分析

將胡蘿卜花芽總RNA（見圖1A）反轉為cDNA，以cDNA第一條鏈為模板進行3'-RACE時PCR擴增產物的大小約為900 bp（見圖1B），5'-RACE的PCR擴增產物大小約為400 bp（見圖1C）。將上述兩片段拼接，獲得其全長cDNA序列。在NCBI上對該cDNA序列進行Blast分析，并將其推導的氨基酸序列與已知的MADS-box蛋白在DNAMAN中進行同源性比對，構建系統進化樹。經上述分析可知，所得序列中有兩個序列具有MADS-box的保守區(qū)域和K區(qū)，其核苷酸序列分別與金魚草的DEFH49和擬南芥的AGL6同源性很高，故將兩個基因分別命名為DcSEP1和DcAGL6。

表1 試驗過程中涉及的引物Table 1 Primers used in the experiment

圖1 胡蘿卜花芽總RNA（A）、3'-RACE PCR產物（B）和5'-RACE PCR產物（C）電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from carrot flower bud(A),3'-RACE PCR products(B)and 5'-RACE PCR products（C）

DcSEP1（見圖2）的cDNA全長1 084 bp，3'-端非翻譯區(qū)為180 bp，poly（A）尾長19個腺苷酸，編碼區(qū)753 bp，對應編碼251個氨基酸，編碼的蛋白質含有59個氨基酸的MADS區(qū)域，34個氨基酸的I區(qū)，65個氨基酸的K區(qū)，與擬南芥的SEPALLATA 3、杧果的SEPALLATA1-like、葡萄的SEPALLATA 1、矮牽牛的MADS-box同源性分別為60.23%、56.52%、70.24%和74.31%。

圖2 DcSEP1的核苷酸序列、推導的氨基酸序列及其與其他SEP-like蛋白的同源比對Fig.2 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of DcSEP1,and homologous comparison among DcSEP1 and other SEP-like proteins

DcAGL6（見圖3）的cDNA全長為1 061 bp，3'-端非翻譯區(qū)為273 bp，poly（A）尾長20個腺苷酸，編碼區(qū)747 bp，對應編碼249個氨基酸，編碼的蛋白質含有57個氨基酸的MADS區(qū)、32個氨基酸的I區(qū)、77個氨基酸的K區(qū)。與擬南芥的AGL6、大麻槿的HcMADS、風信子的HoMADS、矮牽牛的pMADS4同源性分別為58.98%、64.03%、59.36%和61.24%。

圖3 DcAGL6的核苷酸序列、推導的氨基酸序列及其與其他AGL6蛋白的同源比對Fig.Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of DcAGL6,and homologous comparison among DcAGL6 and other AGL6 proteins

2.2 DcSEP1和DcAGL6的系統進化樹分析

為進一步弄清DcSEP1和DcAGL6的進化地位，在GenBank中獲得大量的SEP-like和AGL6基因，并以其推導的氨基酸序列構建系統進化樹。系統進化分析顯示克隆的兩個基因DcSEP1與SEP-like基因歸為同一分支，DcAGL6與AGL6基因聚為同一分支，均屬于E類基因（見圖4）。

2.3 基因特異性RT-PCR分析

為分析胡蘿卜花發(fā)育相關MADS-box基因在野生型花器官中的表達空間特異性，以胡蘿卜的根、莖、葉、萼片、雄蕊和心皮等器官的總RNA為模板，進行基因特異性RT-PCR檢測。

結果見圖5。

由圖5可知，克隆的兩個E類基因DcSEP1和DcAGL6都在營養(yǎng)器官根、莖、葉中無表達。在花器官萼片中也同樣未檢測到，而在心皮和雄蕊中都有微量表達。DcSEP1和DcAGL6在心皮的表達量均高于雄蕊。

圖4 DcSEP1和DcAGL6與其他同類蛋白的進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by DcSEP1,DcAGL6 and their homogeneous proteins

圖5 胡蘿卜MADS-box基因器官特異性表達分析Fig.5 Organ-specific expression analysis of carrot MADS-box genes

3 討論與結論

為了解MADS-box基因在調節(jié)花發(fā)育中的作用，利用RACE方法從胡蘿卜中克隆出兩個MADS-box基因DcSEP1和DcAGL6。將兩個基因與其他種類植物的MAD-box基因進行比較分析后結果顯示：DcSEP1與雙子葉植物矮牽牛的MADS12和金魚草的DEFH49的親緣性最高，而DcAGL6與雙子葉十字花科羽衣甘藍的BoAGL6和擬南芥的ATHAGL6的親緣性最高。由此可見胡蘿卜作為雙子葉植物的進化地位。DcSEP1和DcAGL6與其他物種類基因序列的相似性預示著它們具有相似功能。在過去的10年中，Martin Yanofsky及其同事一直在系統研究擬南芥MADS-box基因[11-12]。開始時，MADS-box基因均通過與AG的同源性來確定。因此，它們都被稱為AGAMOUS-LIKE（AGL）基因。近年來，他們發(fā)現三個序列高度同源且時空表達模式類似的MADS-box基因SEP1（原名AGL2）、SEP2（原名AGL4）和SEP3（AGL9）在花器官的形成中具有極其重要的作用。在花發(fā)育的早期和中期，SEP1和SEP2在所有四輪花器官中都表達[13]，這個研究結果與胡蘿卜所克隆的這兩個基因只在心皮與雄蕊中表達存在差異。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子（cofactor）在各輪花器官決定中發(fā)揮作用[14]。各進化系表達模式存在差異。加州嬰粟（Eschscholzia californica）中EScaAGL9在萼片原基起始后開始表達，主要集中在花瓣、雄蕊和心皮原基中，在花的發(fā)育過程中持續(xù)表達，該基因在發(fā)育的種子中有很高表達水平[15]。雖然E類基因的表達模式在被子植物不同物種中有差異，但該基因對所有花器官的發(fā)育都是必需的，這一功能十分保守[6]。

本試驗克隆的DcSEP1和DcAGL6均屬于E類基因，通過序列分析和進化樹構建進一步了解該類基因在不同物種中的表達，為胡蘿卜花器官研究奠定基礎。但有關其時空表達模式和功能，有待于利用Northern雜交和基因敲除等方法進行深入研究。

[1]Ma H,Yanofsky M F,Meyerowitz E M.AGL1-AGL6,anArabido-psisgene family with similarity to floral homeotic and transcription factor genes[J].Genes Dev,1991,5(3):484-495.

[2]呂山花,孟征.MADS-box基因家族基因重復及其功能的多樣性[J].植物學通報,2007,24(1):60-70.

[3]Jack T.Molecular and genetic mechanisms of floral control[J].Plant Cell,2004,16:s1-s17.

[4]李云.稻花器官突變體fort（t）和spp1的形態(tài)發(fā)、遺傳分析及相關基因的分子標記定位[D].成都:四川農業(yè)大學,2006.

[5]Adam H,Jouannic S,Orieux Y,et al.Functional characterization of MADS-box genes involved in the determination of oil palm flower structure[J].J Exp Bot,2007,58(6):1245-1259.

[6]徐啟江,關錄飛,吳笑女,等.草原龍膽MADS-box基因的克隆及表達分析[J].植物學通報,2008,25(4):415-429.

[7]Murai K,Takumi S,Koga H,et al.Pistilloidy,homeotic transformation of stamens into pistil-like structures,caused by nuclearcytoplasm interaction in wheat[J].Plant J,2002,29:169-181.

[8]Linke B,Nothnagel T,Bǒrner T.Flower development in carrot CMS plants:Mitochondria affect the expression MADS-box genes homologous toGLOBOSAandDEFICIENS[J].Plant J,2003,34(1):27-37.

[9]Carlsson J,Leino M,Sohlberg J,et al.Mitochondrial regulation of flower development[J].Mitochondrion,2008,8(1):74-86.

[10]張振賢.蔬菜栽培學[M].北京:中國農業(yè)大學出版社,2003:324-329.

[11]Ng M,Yanofsky M F.Function and evolution of the plant MADS-box gene family[J].Nat Rev Genet,2001(2):186-195.

[12]Alvarez-Buylla E R,Liljegren S J,Pelaz S,et al.MADS-box gene evolution beyond flowers:Expression in pollen,endosperm,guard cells,roots and trichomes[J].Plant J,2000,24(4):457-466.

[13]Savidge B,Rounsley S D,Yanofsky M F.Temporal relationship between the transcription of twoArabidopsisMADS box genes and the floral organ identity genes[J].Plant Cell,1995,7(6):721-733.

[14]Pelaz S,Ditta G S,Baumann E,et al.B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes[J].Nature,2000,405:200-203.

[15]Zahn L M,Leebens-Mack J H,Arrington J M,et al.Conservation and divergence in the AGAMOUS subfamily of MADS-box genes:Evidence of independent sub-and neofunctionalization events[J].Evol Dev,2006,8(1):30-45.