趙中勝，鐔雪瑩，查恩輝，岳喜慶

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧大學(xué)食品科學(xué)與工程系，遼寧 沈陽 110036；3.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

肉味香精是一種以肉類風(fēng)味為主[1]，采用肉類蛋白水解物和還原糖等為原料通過美拉德反應(yīng)生產(chǎn)的肉類風(fēng)味物。美拉德反應(yīng)分為三個(gè)階段[2]進(jìn)行，最終形成類黑色素。它能賦予熟肉特征香氣，又能一定程度上破壞食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響產(chǎn)品外觀[3]，因此要控制好反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH 等因素[4-6]。采用酸法水解肉類蛋白水解率較高，但水解程度難以控制，水解后的酸液對(duì)環(huán)境污染大[7-8]。堿法水解水解率低、專一性差，容易產(chǎn)生尿素，部分氨基酸會(huì)脫氨而造成氨基酸破壞，尤其是胱氨酸和半胱氨酸容易損失[9]。酶法水解通過控制酶解過程中底物濃度、pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間等影響酶解的因素[10]，副反應(yīng)少、不破壞氨基酸、水解程度容易控制，在營(yíng)養(yǎng)成分的保留上，具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[11-12]。本研究以牛肉蛋白等為基料生產(chǎn)的肉味香精，口感純正、后味足，迎合了消費(fèi)者崇尚天然的消費(fèi)潮流，發(fā)展前景樂觀。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛肉：市購(gòu)；木瓜蛋白酶食品級(jí)（1 000 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶食品級(jí)（130 000 U/g）：天津諾奧科技發(fā)展有限公司；葡萄糖、D-木糖、L-半胱氨酸、硫胺素：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TDL-5-A 型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解液的制備

取適量牛肉，去除脂肪[13]，置于高速組織搗碎機(jī)10 000 r/min 處理1 min。稱取肉糜100 g，移入三角瓶中，加入一定量的蒸餾水，用1 mol/L 氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，在一定溫度下加入適量蛋白酶（木瓜蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶=1∶1），攪拌均勻，酶解后升溫到90 ℃滅酶15 min。在4 000 r/min 下離心分離20 min，收集上清液（蛋白水解液：HAP）分析測(cè)定。

1.3.2 酶解工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，酶解反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、初始pH 以及酶添加量4 個(gè)因素對(duì)水解度的影響較為顯著，因此選擇L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)4 個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化。因素及水平選取如表1 所示。

表1 蛋白酶水解條件正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表L9（34）Table 1 The factors and level

1.3.3 氨基氮含量測(cè)定

甲醛電位滴定法[14]。

1.3.4 水解液的游離氨基酸組成分析

利用日立L-8800 型氨基酸分析儀。

1.3.5 Maillard 反應(yīng)制備牛肉味香精

蛋白水解液→加入還原糖、氨基酸和水→調(diào)pH→Maillard 反應(yīng)→真空冷凍干燥→香精

1.3.6 Maillard 反應(yīng)工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，反應(yīng)時(shí)間、溫度、初始pH 以及HAP 添加量4 個(gè)因素對(duì)香精風(fēng)味的影響較為顯著，因此選擇L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)4 個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化。因素及水平選取如表2 所示。

表2 美拉德反應(yīng)條件正交試驗(yàn)的因素水平表L9（34）Table 2 The factors and level

1.3.7 香味評(píng)價(jià)的方法[15]

采用感官評(píng)分法進(jìn)行香味評(píng)價(jià)。感官評(píng)分法是指按預(yù)先設(shè)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)試樣的特性和嗜好程度以數(shù)字標(biāo)度進(jìn)行評(píng)定，然后換算成得分的一種評(píng)價(jià)方法。本試驗(yàn)采用1～9（9 級(jí)）尺度，依次代表非常厭惡、很厭惡、一般厭惡、有些厭惡、既不厭惡也不喜歡、有些喜歡、一般喜歡、很喜歡、非常喜歡。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)

本試驗(yàn)對(duì)酶解反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、初始pH 以及酶添加量4 個(gè)參數(shù)進(jìn)行正交優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal test of enzymolysis

從表3 可知，各因素對(duì)牛肉酶解效應(yīng)影響由大到小依次為：A＞C＞B＞D，即pH＞加酶量＞酶解溫度＞反應(yīng)時(shí)間。

挑取每個(gè)因素K 值最大的水平組合作為優(yōu)方案，由表3 可知，優(yōu)方案為A3C3B3D2，即pH7.0、加酶量為0.7%、反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，氨基酸含量為0.420 g/100 mL，含量最高。

2.2 水解液的游離氨基酸組成分析

利用日立L-8800 型氨基酸分析儀對(duì)牛肉蛋白水解液進(jìn)行游離氨基酸組成分析，其結(jié)果見圖1。

圖1 氨基酸分析圖Fig.1 Beef protein hydrolysates of Amino Acid Analysis

由圖1 可知，酶解產(chǎn)物中含量較豐富的幾種游離氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸，這是牛肉酶解產(chǎn)物鮮的重要原因；酶解產(chǎn)物中富含必需氨基酸：賴氨酸、色氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸，酶解液中的含硫氨基酸尤其是半胱氨酸的比例很小，而含硫氨酸對(duì)于肉香風(fēng)味的生成非常重要，因此在美拉德反應(yīng)體系中加入半胱氨酸是非常必要的。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，采用香味評(píng)價(jià)的方法對(duì)不同的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)價(jià)，以得到較佳的美拉德反應(yīng)的條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 美拉德反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal test of Maillard reaction

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，極差大小順序?yàn)镽C＞RD＞RB＞RA，所以各因素主次順序?yàn)椋篊（pH）＞D（HAP添加量）＞B（時(shí)間）＞A（溫度）。由K 值可知，優(yōu)方案為C3D3B3A2，即pH7.0、HAP 添加量60%、時(shí)間115 min、溫度105 ℃，在此條件下可得到香氣較強(qiáng)且協(xié)調(diào)的肉味香精。

3 結(jié)論

1）牛肉水解最佳工藝參數(shù)為：pH7.0、加酶量0.7%、反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時(shí)間3 h。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，氨基酸含量為0.420 g/100 mL。

2）美拉德反應(yīng)底物配料最佳配比為：牛肉酶解物添加量為60 g；葡萄糖添加量為34 g、木糖添加量為3.4 g；L-半胱氨酸17g；硫胺素添加量為5.6 g。

3）美拉德反應(yīng)的最佳條件為：pH7.0、HAP 添加量60 %、時(shí)間115 min、溫度105 ℃，在優(yōu)化條件下得到的牛肉香精，肉香濃郁，烤肉味特征香氣明顯，留香時(shí)間久。

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