張玉芳，曲慧，單守水，郭盡力

（1.煙臺汽車工程職業(yè)學院，山東 煙臺 265500；2.煙臺大學，山東 煙臺 264000）

脂肪酶（甘油酯水解酶，EC3.1.1.1）能在異相系統(tǒng)的油-水界面上起催化作用，水解甘油酯、酯、硫酰鍵、酰胺鍵，在非水相中又能催化酯交換、酯化、轉(zhuǎn)酯[1]等反應。近年來對很多脂肪酶在油脂的水解研究、油脂改良、酯合成、酯交換等方面的應用得到了飛速發(fā)展，特別是它們對甘油三酯的1，3 位酯鍵有高度的專一性而被廣泛應用于結(jié)構(gòu)酯的研究和生產(chǎn)中。

游離酶催化反應技術雖成熟但工業(yè)化成本高而難以推廣，固定化是提高酶效率的更佳形式。脂肪酶的固定有多種方法，主要有吸附法、共價法、交聯(lián)法、包埋法[2-3]等。由脂肪酶催化的并具有重要應用價值的酯交換和酯合成反應往往在非水有機介質(zhì)中進行，而脂肪酶一般不溶于這些介質(zhì)，用吸附法固定的脂肪酶在這些介質(zhì)中有著比在水相中更好的穩(wěn)定性，同時以吸附法固定脂肪酶還有操作簡單、酶活回收率高、成本低等優(yōu)點，因此吸附法是固定脂肪酶的一種重要的、更加有效的方法。硅藻土是一種用途廣泛而又價格低廉的吸附載體，但還未見用于脂肪酶固定的報道。本文以硅藻土為吸附載體，對在我國有廣泛資源的豬胰脂酶的固定作初步研究。為脂肪酶的工業(yè)應用提供了一些科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬胰臟：購于煙臺初家肉食品加工廠；豬油：新鮮豬板油濕法熬制（煙臺大學酶工程實驗室自制）；花生油（精煉）：煙臺正和植物油廠。

1.2 方法

1.2.1 豬胰脂酶的提取

將5 kg 新鮮豬胰去其所結(jié)合的油脂及其它組織，0 ℃搗碎成漿狀。加入1 000 mL 無水丙酮，不斷攪拌提取4 h～6 h，4℃，8 000 r/min 離心15 min，分離上清液。沉淀再加入1 000 mL 無水丙酮，攪拌提取4 h～6 h，離心分出液體。如此反復三四次后再加入1 000 mL 無水丙酮與乙醚的混合液（體積比1∶1）如上法進行兩次提取。合并上清液，真空下干燥48 h，可得到穩(wěn)定的固體粉狀物。放置冰箱保存。

1.2.2 酶活力測定

以乳化狀態(tài)的花生油為底物，用0.1 mol/L 的NaOH進行連續(xù)滴定，pH 保持在8.3，在37 ℃恒溫下進行數(shù)分鐘。讀出NaOH 的體積消耗量，計算出每分鐘所消耗的NaOH 的量，從而計算出酶活。

1.2.3 豬胰脂酶的固定化

稱取6 g 酶加入24 mL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.5）在0 ℃下攪拌20 min，12 000 r/min 離心10 min，留上清棄沉淀。加入6 g 硅藻土攪拌1 h。加入6 mL（-20 ℃）的丙酮，攪拌15 min。用沙芯漏斗抽濾，用2×10 mL 丙酮洗兩次，真空干燥箱中干燥12 h。所得固定化酶放入冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶促酯交換

稱取一定量（80 mg）的固定化酶加入到10 mL 的小試管中，加入適量（2 mL）的Tris.HCl 緩沖液對酶進行活化。后加入一定量（0.1 mL）的花生油，加0.5 mL 膽酸鈉，加0.2 mL 的二氯化鈣在40 ℃保溫水解5 min（使之完全水解）取出振蕩。加入4 mL 異丙醇，加入0.3 g 豬油脂肪酸振蕩，40 ℃保溫30 min。取出后加入3 mL 無水乙醚。取上層液點樣。

1.2.5 脂肪酸組成分析

向盛有樣品的燒瓶中加入4 mL NaOH 甲醇溶液，加熱回流5min～10min。加入5mLBF3甲醇溶液，加熱回流1min。加入2mL～5mL 環(huán)己烷，加熱回流1min。斷熱，加入少量飽和NaCl 溶液，振蕩。加入大量飽和NaCl 至瓶頸。取上層液，加無水Na2SO4除去水分。作氣相分析。

色譜條件為儀器：島津GC—14C，檢測器：氫火焰檢測器（FID），色譜柱：石英毛細管（長60 m），固定液：聚乙二醇（PEG），柱溫：190 ℃～210 ℃，氣化室溫度：250 ℃，檢測器溫度：250 ℃，氮氣（載氣）流速：30 mL/min，氫氣壓力：0.5 kg/cm2，空氣（O2）壓力：0.5 kg/cm2。

2 結(jié)果與討論

2.1 豬胰脂酶的提取

豬胰臟提取得到提取物80 g，得率為1.6%，測得酶活為6.95 nkat。

2.2 脂肪酶的固定化及影響酶活的因素

2.2.1 脂肪酶的固定化

酶的固定化技術包括吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合及包埋等四種方法。載體的選擇必須考慮以下因素：機械強度、抗微生物作用、熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、化學功能性、親油/親水特性、易再生、負載能力及其價格。選擇固定化方法時要考慮總酶活，酶利用率，失活，再生特性，固定化所需費用，所用固定化試劑的毒性及其所要求的固定化酶的最終特性。硅藻土含有88%的硅及水生硅藻碎片，能溶于濃堿和氫氟酸，能吸附大于自身四倍的水，不溶于水、酸或堿。是固定化酶的理想的載體。本試驗選用硅藻土作載體，通過物理吸附法固定脂肪酶。

通過固定化，得到穩(wěn)定的固定化胰脂酶。固定化酶的得率為81.1%。

2.2.2 固定化酶的酶活

固定前酶活為2.55nkat，固定后酶活為4.01nkat。固定化后酶活有了較大的提高，固定化后，硅藻土作為載體將酶吸附于其上。因為其表面積較大，這樣酶與底物接觸的面積大大提高，從而提高了酶的催化效率，提高了酶的活性。

固定化酶的時間—NaOH 體積曲線如圖1 所示。

圖1 固定化酶的時間--NaOH 體積曲線Fig.1 Curve of immobilized enzyme time and NaOH

由圖1 可以看出固定化酶的滴定曲線在開始一段比較接近直線，隨后變化緩慢，因為固定化酶的酶表面積增大，酶的催化效率顯著提高，在極短的時間內(nèi)就可以將底物水解，隨著底物的減少，所釋放的脂肪酸減少，所消耗的NaOH 體積變小。在曲線的后半部分基本接近水平。

2.3.3 影響固定化酶活的因素

2.3.3.1 pH 對固定化酶的影響

通過固定其它條件，改變緩沖液pH，可以發(fā)現(xiàn)隨著pH 的變化固定化酶活性相應地發(fā)生變化，見圖2。

固定化酶酶活與緩沖液的pH 關系呈鐘罩形曲線。因為游離態(tài)的脂肪酶的等電點5.2[4]，在pH 為6～8時其穩(wěn)定性最高[5]，本試驗確定pH 為6.5。

2.3.3.2 緩沖液的離子強度對固定化酶的影響

緩沖液的離子強度對固定化酶酶活的關系見圖3。

圖2 酶活與溶液pH 關系Fig.2 Relationship between enzyme activity and pH

圖3 酶活與溶液離子強度的關系Fig.3 Relationship between activity and ionic strength

隨著離子強度的增加，酶活逐漸增加，但進一步增加離子強度將導致酶活的降低[6]。在離子強度為0.03 mol/L 時，表現(xiàn)出最大酶活。

2.3.3.3 時間對固定化酶的影響

通過研究固定化時間對固定化酶的酶活的影響，可以發(fā)現(xiàn)當固定化時間為1 h 時，其酶活基本上達到最大酶活。繼續(xù)延長時間對酶活影響不大。因為，酶固定化過程受載體顆粒內(nèi)擴散速率控制。即酶在顆粒孔隙內(nèi)遷移至吸附點，而后被固定化。顯然，在經(jīng)過一段時間后，酶的遷移、吸附與解析間將達到平衡。繼續(xù)延長時間，將不改變其平衡狀態(tài)[7]。

通過以上研究，得出酶固定化的最佳條件pH6.5，離子強度為0.03 mol/L，固定化時間為1 h。

2.4 酶促酯交換

采用花生油和豬油作為底物進行酯交換，通過氣相色譜分析，得出花生油、豬油、改造油的脂肪酸的組成如表1。

表1 花生油、豬油、改造油的脂肪酸的組成Table 1 The composition of peanut oil，lard oil and transformation oil

續(xù)表1 花生油、豬油、改造油的脂肪酸的組成Continue table 1 The composition of peanut oil，lard oil and transformation oil

由表1 可知改造油的脂肪酸組成和豬油的脂肪酸組成在百分含量上較為接近，但改造油的脂肪酸的種類要比豬油的脂肪酸的種類少的多。改造油的脂肪酸組成和花生油的脂肪酸的組成相差較大。

從表1 可以看出，改造油是由花生油和豬油的脂肪酸進行的酯交換反應，在三種主要脂肪酸上，軟脂酸、硬脂酸含量較豬油有提高，但基本上接近，油酸的含量有所下降，而且這三種脂肪酸含量趨向于平均化。表明該工藝制備的固定化脂肪酶可用于油脂的改性加工。

3 結(jié)論

1）豬胰脂酶固定化最佳條件為：pH 6.5，離子強度0.03 mol/L，固定化時間1 h。

2）以固定化豬胰脂酶為催化劑，以花生油和豬油的脂肪酸為底物進行酯交換，得到的改造油的脂肪酸組成和豬油較為接近，軟脂酸、硬脂酸含量較豬油有所提高，油酸的含量有所下降。表明該工藝制備的固定化脂肪酶可用于油脂的改性加工。

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