楊 敏，楊國龍，楊力會(huì)，畢艷蘭，安曉東（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

無溶劑體系下表面活性劑修飾的豬胰脂酶催化酯交換反應(yīng)的研究

楊 敏，楊國龍*，楊力會(huì)，畢艷蘭，安曉東
（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

在水溶液中，采用Tween40、蔗糖酯S970、Span60三種表面活性劑修飾豬胰脂酶（porcine pancreas lipase，PPLipase）；再以修飾的豬胰脂酶（Tween40-PPLipase、S970-PPLipase、Span60-PPLipase）為催化劑，在無溶劑體系中催化茶油與亞油酸酯交換反應(yīng)。結(jié)果表明，在酶促反應(yīng)達(dá)到平衡前，隨著加酶量的增加酯交換量也隨之增加；在相同的加酶量下，Tween40-PPLipase、S970-PPLipase和Span60-PPLipase催化酯交換的速率均高于PPLipase催化酯交換的速率；加酶量5%時(shí)，2h時(shí)PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量為16.1%，Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase和S970-PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量分別為20.4%、21.1%和22.4%。達(dá)到平衡時(shí)，Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase、S970-PPLipase和PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量基本相同，均為25%左右。

豬胰脂肪酶，酯交換，無溶劑體系，表面活性劑

酶促反應(yīng)具有溫和、專一、催化效率高的特點(diǎn)，隨著酶學(xué)研究的進(jìn)展，脂肪酶及其改性制劑廣泛應(yīng)用于食品營養(yǎng)、藥物合成及生物表面活性劑的合成等諸多領(lǐng)域中[1]，目前，油脂工業(yè)應(yīng)用最多的酶是脂肪酶。

脂肪酶是一類特殊的作用于油水界面上的酯鍵水解酶，應(yīng)用于油脂水解[2]，以及有機(jī)相中催化酯合成[3]和酯交換反應(yīng)[4-7]。由于脂肪酶在底物油脂反應(yīng)中不易分散，需要借助有機(jī)溶劑體系來分散，而有機(jī)溶劑易導(dǎo)致脂肪酶的變性、失活，為了提高脂肪酶的活性[8-9]，很多學(xué)者對脂肪酶的修飾[4-7，10-11]進(jìn)行了研究。孫江彥等[12]以酯交換量為指標(biāo)，研究了醇溶液體系中蔗糖酯修飾豬胰脂酶的條件，并比較了修飾酶與未修飾酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示蔗糖酯修飾的豬胰脂酶的熱穩(wěn)定性較豬胰脂酶高。曾俊等[13]研究了乙醇溶液中Span20、Span80和Span85修飾的豬胰脂酶催化茶油與亞油酸酯交換反應(yīng)，結(jié)果表明修飾豬胰脂酶催化酯交換的行為與表面活性劑的類型和反應(yīng)溫度有關(guān)。

本研究以水溶液中司盤60、吐溫40、蔗糖酯970修飾的豬胰脂肪酶為催化劑，催化無溶劑體系中茶油與亞油酸的酯交換反應(yīng)，比較修飾酶與原酶催化酯交換行為的差異，考察水溶液中表面活性劑修飾脂肪酶的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬胰脂酶（PPLipase） 自制；亞油酸 自制（含量＞95%）；茶油 購于河南信陽長園野生茶油有限公司；Span60（山梨醇酐單硬脂酸酯，親水親油平衡值（HLB）=4.7）和Tween40（聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，HLB=15.5） 購于Sigma公司；S970（硬脂酸蔗糖酯，HLB=9.0） 購于日本三菱公司；其他化學(xué)試劑 購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純。

氣相色譜儀（Agilent6890N） 美國Agilent公司；色譜柱BPX-70（30.0m×250μm×0.25μm） 澳大利亞SGE公司；KDN-08C定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；ZF-I型紫外分析儀 上海康華生化儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表面活性劑修飾豬胰脂酶的方法 稱取一定量的表面活性劑Span60、Tween40、S970溶解于相應(yīng)的pH緩沖溶液中，再緩慢加入一定量的豬胰脂肪酶，在25℃下攪拌均勻后，繼續(xù)緩慢攪拌并計(jì)時(shí)，達(dá)到指定時(shí)間后停止攪拌，然后在3500r/min下離心15min棄去上清液，取沉淀，冷凍干燥（冷肼溫度-56℃）24h后取出，用研缽研磨成粉狀，即得修飾后豬胰脂肪酶Span60-PPLipase、Tween40-PPLipase、S970-PPLipase。工藝流程如圖1所示，修飾條件見表1。

圖1 表面活性劑修飾豬胰脂肪酶的工藝過程Fig.1 Modification process of PPLipase by surfactants

表1 表面活性劑修飾豬胰脂肪酶的條件Table 1 Modification conditions of PPLipase by surfactants

1.2.2 酶的蛋白質(zhì)含量測定 PPLipase和修飾PPLipase的蛋白質(zhì)含量按GB 5009.5-2010測定。

1.2.3 表面活性劑的修飾作用對PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響 稱取10g茶油于50mL圓底燒瓶中，加入一定量的亞油酸，茶油∶亞油酸=1∶2（mol/mol），再加入一定量的蒸餾水（按茶油質(zhì)量的0.4%計(jì)），在50℃溫度下攪拌均勻后，緩慢加入PPLipase或修飾的PPLipase（以含氮量為基準(zhǔn)，添加量為茶油質(zhì)量的5%），開始計(jì)時(shí)，每隔一定時(shí)間取樣，分離產(chǎn)物中的甘三酯，并采用氣相色譜法分析產(chǎn)物中甘三酯的全樣脂肪酸組成，計(jì)算酯交換過程中酯交換量，考察表面活性劑的修飾作用對PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響。酯交換量計(jì)算公式如下：

酯交換量（%）=L0-Lp

式中：L0：原料茶油中亞油酸的質(zhì)量百分含量；Lp：產(chǎn)物甘三酯中亞油酸的質(zhì)量百分含量。

1.2.4 加酶量對酶催化酯交換反應(yīng)的影響 稱取10g茶油于50mL圓底燒瓶中，加入一定量的亞油酸，茶油∶亞油酸=1∶2（mol/mol），再加入一定量的蒸餾水（按茶油質(zhì)量的0.4%計(jì)），在50℃溫度下攪拌均勻后，緩慢加入PPLipase或修飾的PPLipase（以含氮量為基準(zhǔn)，添加量為茶油質(zhì)量的5%、10%、15%、20%），開始計(jì)時(shí)，每隔一定時(shí)間取樣，分離產(chǎn)物中的甘三酯，并采用氣相色譜法分析產(chǎn)物中甘三酯的全樣脂肪酸組成，計(jì)算酯交換過程中酯交換量，考察加酶量對催化酯交換反應(yīng)的影響。酯交換量計(jì)算見1.2.3。

1.2.5 產(chǎn)物中甘三酯的分離與全樣脂肪酸組成分析 取0.4mL反應(yīng)產(chǎn)物置于離心管中，加入0.8mL石油醚溶解，混勻后，將混合樣品進(jìn)行薄層色譜分離，使用硅膠G為吸附劑，石油醚∶無水乙醚∶甲酸=70∶30∶1（v/v/v）展開劑展開后，在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，將2，7-二氯熒光素均勻噴灑在薄層板上顯色，晾干后在紫外分析儀上觀察譜帶。

刮下待分析的甘三酯譜帶于試管中，加入4mL 0.5mol/L的甲醇鈉溶液和2.4mL的正己烷后，封口，劇烈晃動(dòng)7min，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min，吸取上清液于另一潔凈試管中，加入無水硫酸鈉去除痕量水分，待氣相色譜檢測。

氣相色譜分析條件：毛細(xì)管脂肪酸分析色譜柱，BPX-70（30.0m×250μm×0.25μm）；檢測器，氫火焰離子檢測器；進(jìn)樣口溫度，230℃；柱溫，180℃；檢測器溫度，300℃；氮?dú)饬魉伲?.5mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

所有數(shù)據(jù)均為雙實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用SPSS 2.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

表2 修飾后豬胰脂肪酶與原酶的蛋白質(zhì)含量（n=2）Table 2 Protein content of PPLipase and modified PPLipases（n=2）

2 結(jié)果與討論

2.1 未修飾酶及修飾后的PPLipase中蛋白質(zhì)含量

如表2所示，3種表面活性劑修飾的PPLipase的蛋白質(zhì)含量在70%～80.5%之間，均低于（p＜0.05）原PPLipase的蛋白質(zhì)含量（86.96%），且不同表面活性劑修飾的PPLipase的蛋白質(zhì)也存在一定差異，這是因?yàn)橹久感揎椀倪^程中酶蛋白質(zhì)與表面活性劑間作用力的差異，導(dǎo)致相同質(zhì)量的脂肪酶結(jié)合表面活性劑的量有所不同，且修飾后酶的蛋白質(zhì)含量降低。

2.2 修飾作用對豬胰脂酶催化酯交換反應(yīng)的影響

表面活性劑修飾的PPLipase催化酯交換反應(yīng)的酯交換量隨時(shí)間的變化如圖2所示。由圖2可知，修飾后的豬胰脂酶催化酯交換達(dá)到平衡的時(shí)間較PPLipase催化反應(yīng)達(dá)平衡的時(shí)間短，PPLipase催化反應(yīng)達(dá)平衡的時(shí)間是6h，而三種修飾后的PPLipase催化的酯交換達(dá)平衡的時(shí)間是4h。在反應(yīng)達(dá)平衡前，相同時(shí)間內(nèi)，修飾后的PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量遠(yuǎn)大于PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量（p＜0.01），2h時(shí)PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量為16.1%，Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase和S970-PPLipase催化反應(yīng)的酯交換量分別為20.4%、21.1%、22.4%；三種修飾豬胰脂酶催化反應(yīng)的酯交換量沒有顯著差別（p＞0.05）。酯交換反應(yīng)達(dá)平衡后（4h后），隨反應(yīng)時(shí)間的延長，修飾PPLipase催化酯交換反應(yīng)的酯交換量沒有顯著差別（p＞0.05）。這說明，采用非離子表面活性劑在水溶液中對PPLipase進(jìn)行修飾，能顯著提高其催化酯交換的活性；但Tween40、Span60和S970對PPLipase的修飾效果無顯著差別。曾俊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇溶液中用Span修飾PPLipase也能提高其催化酯交換反應(yīng)的活性。

微觀上看，酶催化酯交換反應(yīng)是界面催化，酶分子自身的性質(zhì)會(huì)影響反應(yīng)的傳質(zhì)。表面活性的極性部分與脂肪酶（本質(zhì)是蛋白質(zhì)）表面的親水性基團(tuán)產(chǎn)生親水相互作用。而作為一種蛋白質(zhì)，脂肪酶表面肯定會(huì)存在一定數(shù)量的疏水性基團(tuán)，且酶的活性部位是由疏水性氨基酸組成的，該區(qū)域表現(xiàn)為疏水性，表面活性的疏水部分與脂肪酶表面的疏水性基團(tuán)通過疏水相互作用進(jìn)行結(jié)合。表面活性劑與脂肪酶間可通過親水相互作用和疏水相互作用形成表面活性劑-脂肪酶復(fù)合物，酶表面性質(zhì)得到改善從而使得酶的催化活性增加。

圖2 PPLipase和修飾的PPLipase催化酯交換過程中酯交換量隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes of acyl incorporation with reaction time increasing during interesterification catalyzed by PPLipase and modified PPLipases

2.3 加酶量對豬胰脂酶催化酯交換反應(yīng)的影響

由圖3～圖6可知，就PPLipase、Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase和S970-PPLipase催化酯交換反應(yīng)而言，相同時(shí)間的酯交換量隨著加酶量的增大而逐漸提高，即酯交換速率隨加酶量的增加而增加，反應(yīng)達(dá)平衡的時(shí)間隨之變小。加酶量由5%增加到10%時(shí)，四種酶催化酯交換的速率均顯著提高（p＜0.01）；由10%增加到15%變化時(shí)，四種酶催化酯交換的速率有所提高（p＜0.05）；由15%增加到20%時(shí)，PPLipase的酯交換速率略有提高（p＜0.05），Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase和S970-PPLipase三種修飾酶的酯交換速率幾乎沒有變化（p＞0.05）。原因是當(dāng)增大加酶量時(shí)，擴(kuò)大了催化劑與反應(yīng)底物之間的接觸面積，從而提高了酯交換的反應(yīng)速率。隨著加酶量的進(jìn)一步增大，底物逐漸被酶所飽和，僅有一部分酶參加了酯交換反應(yīng)，飽和的修飾酶參與反應(yīng)的催化活性高于原酶，即加酶量由15%增加到20%時(shí)，修飾酶與原酶的酯交換速率變化有所不同。楊國龍等[14]研究了無溶劑體系下PPLipase催化油茶籽油與亞油酸甲酯酯交換反應(yīng)酯交換量的變化，加酶量由5%增加到15%時(shí)，20h時(shí)的酯交換量隨著加酶量的增加逐漸上升，加酶量大于15%后變化不大。

圖3 加酶量對PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of enzyme load on interesterification catalyzed by PPLipase

圖4 加酶量對Tween40-PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of enzyme load on interesterification catalyzed by Tween40-PPLipase

對于PPLipase催化的酯交換反應(yīng)而言，加酶量5%時(shí)，達(dá)平衡需要6h；10%時(shí)達(dá)平衡需要4h；加酶量15%和20%時(shí)，達(dá)平衡需要2～3h。對于Tween40-PPLipase、Span60-PPLipase和S970-PPLipase催化酯交換反應(yīng)來說，加酶量5%時(shí)，達(dá)平衡需要4h；10%時(shí)達(dá)平衡需要2～3h；加酶量15%和20%時(shí)，達(dá)平衡需要1.5～2h。反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)，四種酶的催化酯交換反應(yīng)的酯交換量均為25%左右。這是由于所有反應(yīng)的底物及反應(yīng)條件均相同，此反應(yīng)的平衡常數(shù)與加酶量無關(guān)，加酶量只能影響酯交換的反應(yīng)速率，即平衡時(shí)的酯交換量基本相同。

圖5 加酶量對Span60-PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of enzyme load on interesterification catalyzed by Span60-PPLipase

圖6 加酶量對S970-PPLipase催化酯交換反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of enzyme load on interesterification catalyzed by S970-PPLipase

3 結(jié)論

非離子表面活性劑Span60、Tween40、S970在水溶液中修飾豬胰脂酶能達(dá)到其在醇溶液中的修飾效果，即能提高豬胰脂酶催化酯交換反應(yīng)的催化活性，雖然不同表面活性劑的修飾效果有所不同，但差別不明顯。

[1]郭諍，張根旺．脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)修飾[J]．中國油脂，2003，28（7）：5-10.

[2]Luddy FE，Barford RA，Herb SF，et al.Pancreatic lipase hydrolysis of triglycerides by a semimicro technique[J].J Am Oil Chem Soc，1964，41（10）：693-696.

[3]曾哲靈，高道龍，龍俊敏，等．胰脂肪酶催化樟樹籽仁油和甘油合成中碳鏈單甘油酯[J]．中國油脂，2012，37（1）：23-28.

[4]Mogi KI，Nakajima M，Mukataka S.Surfactant modification of lipases for lipid interesterification and hydrolysis reactions[J].J Am Oil Chem Soc，1999，76（11）：1259-1264.

[5]Goto M，Kamiya N，Miyata M，et al.Enzymatic esterification by surfactant-coated lipase in organic media[J].Biotechnol Prog，1994，10（3）：263-268.

[6]Matsushima A，Kodera Y，Takahashi K，et al.Ester-exchange reaction between triglycerides with polyethylene glycol-modified Lipase[J].Biological Chem，1986，8（2）：73-78.

[7]Basheer S，Nakajima M，Cogan U.Sugar ester-modified Lipase for the esterification of fatty acids and long-chain alcohols [J].J Am Oil Chem Soc，1996，73（11）：1475-1479.

[8]Kaimal TNB，Saroja M.Enhancement of catalytic activity of porcine pancreatic Lipase by reductive alkylation[J].Biotechnol，1989，11（1）：31-36.

[9]張中義，吳新俠，孟令艷，等．超高壓下豬胰脂肪酶催化橄欖油水解特性的研究[J]．食品科技，2009，34（1）：10-13.

[10]張潔，楊國龍，畢艷蘭，等．乙醇溶液中Tweens對豬胰脂酶的修飾作用[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（4）：44-47.

[11]Kamiya N，Goto M，Nakashio F.Surfactant-coated Lipase suitable for the enzymatic resolution of menthol as a biocatalyst in organic media[J].Biotechnol，1995，11（3）：270-275.

[12]孫江彥，楊國龍，畢艷蘭，等．醇溶液體系中蔗糖酯修飾豬胰脂酶的研究[J]．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（2）：4-7.

[13]曾俊，楊國龍，畢艷蘭，等．無溶劑體系中Span修飾的豬胰脂酶催化茶油與亞油酸酯交換[J]．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：10-13.

[14]楊國龍，王夢華，王業(yè)濤，等．影響豬胰脂肪酶催化油茶籽油與亞油酸甲酯酯交換過程中酯交換量和?；灰埔蛩氐难芯縖J]．中國油脂，2010，35（10）：38-41.

Study on the interesterification catalyzed by surfactants modified porcine pancreas lipase in solvent free system

YANG Min，YANG Guo-long*，YANG Li-hui，BI Yan-lan，AN Xiao-dong
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

The porcine pancreas lipase（PPLipase）was modified by Tween40，Sucrose ester S970 and Span60 in aqueous solution，and then the Tween40-PPLipase，S970-PPLipase and Span60-PPLipase were used to catalyze the interesterification of camellia and linoleic acid in solvent free system.The results indicated that the acyl incorporation（Ia）was increased with the enzyme loading increasing before the reaction balance reached. The interesterification volecities of the reactions catalyzed by Tween40-PPLipase，Span60-PPLipase and S970-PPLipase were higher than that catalyzed by PPLipase when the enzyme loadings were same.At enzyme load 5%level，the Ia of the interesterifiecation catalyzed by PPLipase was 16.1%at 2h，however the Ias of the interesterification catalyzed by Tween40-PPLipase，Span60-PPLipase and S970-PPLipase were 20.4%，21.1%and 22.4%，respectively.When the reaction balance reached，the Ias of the interesterifications catalyzed by Tween40-PPLipase，S970-PPLipase，Span60-PPLipase and PPLipase were same roughly，about 25%.

porcine pancreas lipase；interesterification；solvent free system；surfactant

TS229

A

1002-0306（2014）12-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.029

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

楊敏（1987-），女，碩士研究生，研究方向：脂質(zhì)化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071558）。