舒 暢，姜琛璐，鐘慈平，李 林（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

三種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立

舒 暢，姜琛璐，鐘慈平，李 林*
（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

目的：建立同時(shí)快速檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的多重PCR方法。方法：根據(jù)沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因及腸出血性大腸桿菌O157∶H7的uidA基因設(shè)計(jì)3對引物，通過單因素實(shí)驗(yàn)、L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系，并對多重PCR擴(kuò)增的敏感性進(jìn)行分析。結(jié)果：3對引物能特異性擴(kuò)增出495、620、252bp的目的片段；在最優(yōu)多重PCR反應(yīng)體系下，多重PCR檢測3種致病菌的靈敏度達(dá)104CFU/mL；將該法應(yīng)用于人工污染實(shí)驗(yàn)，可在5h內(nèi)得到準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測結(jié)果。結(jié)論：該方法操作簡單、檢測特異性和靈敏度較高，能夠?qū)崿F(xiàn)對沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7 3種食源性致病菌的快速監(jiān)控和診斷。

食源性致病菌，多重PCR，沙門氏菌，志賀氏菌，腸出血性大腸桿菌O157∶H7

食品安全是當(dāng)前世界公共衛(wèi)生問題的焦點(diǎn)，近年來，食品安全事件頻繁發(fā)生，其中食源性疾病以其高發(fā)病率成為食品安全面臨的最突出問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年的食源性疾病病例多達(dá)數(shù)十億例，其中有220萬人因此而喪生[1]。引起食源性疾病的首要危害因子是食源性致病菌，其來源多樣、繁殖迅速[2]，常見的有沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、單增李斯特菌（Listeria Monocytogens）等[3]。目前，對食源性致病菌的檢測多采用常規(guī)培養(yǎng)法、免疫法等[4]，程序繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，難以滿足公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速、準(zhǔn)確的需要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的誕生，針對如沙門氏菌[5]、金黃色葡萄球菌[6]、志賀氏菌[7]、單增李斯特菌[8]等某一種菌或某一類致病菌的PCR方法得以建立，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，提高了檢測效率及準(zhǔn)確性。然而，在食品工業(yè)高速發(fā)展的今天，食品的污染情況更為復(fù)雜，污染致病菌的不確定性及多樣性使檢測工作的難度加大，容易誤檢或漏檢[9-10]，因此，建立一種高效、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測方法迫在眉睫。多重PCR技術(shù)為此提供了可能，它可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中，使用多對特異性引物，完成對多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定[11]，具有快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的特點(diǎn)，是未來食源性致病菌檢測技術(shù)的主要發(fā)展趨勢[12]。

沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌是三種常見的食源性致病菌，均屬腸桿菌科，其形態(tài)和生理特性較相似，容易交叉污染，引起食物中毒[13]。采用多重PCR技術(shù)同時(shí)對該三種菌進(jìn)行檢測具有較大的實(shí)用價(jià)值，然而，國內(nèi)外在這方面的研究成果較少。本研究通過引物設(shè)計(jì)、單因素、正交實(shí)驗(yàn)確定了方法，并通過特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)對該方法進(jìn)行了效果驗(yàn)證，并分析了實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題及解決方案，以期為快速檢測食源性致病菌、有效控制病原菌傳播、預(yù)防食物中毒、減少疾病發(fā)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株編號(hào)、名稱及來源 見表1；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；10×PCR Buffer（Mg2+free）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP Mixture（2.5mmol/L each）、rTaq DNA polymerase（5U/μL）、6×DNA loading Buffer、100bp DNA ladder、DL1000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；沙門氏菌、志賀菌屬瓊脂平板（ss瓊脂）、麥康凱瓊脂平板 重慶龐統(tǒng)醫(yī)療器械有限公司；O157顯色培養(yǎng)基 鄭州博賽技術(shù)股份有限公司；腦心浸液肉湯 英國OXOID公司。

PTC-200核酸擴(kuò)增儀 美國MJ公司；DYY-11電泳儀 北京市六一儀器廠；ChemiDoc XRS凝膠成像儀 美國伯樂公司；eppendorf離心機(jī) 德國eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)三種食源性致病菌的特異性保守序列[14-16]，即沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因和腸出血性大腸桿菌的uidA基因，利用軟件Oligo6.0、Primer5.0[17]設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 菌株及其來源Table 1 Strains in this study

表2 多重PCR引物序列Table 2 Primers for multiplex PCR

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及模板DNA的制備 將沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7分別接種于腦心浸液肉湯中，36℃過夜培養(yǎng)，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備模板DNA，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR反應(yīng)

1.2.3.1 單重PCR體系的建立及引物特異性驗(yàn)證 分別以3株沙門氏菌、2株志賀氏菌、2株腸出血性大腸桿菌O157∶H7的基因組DNA為模板，采用25μL反應(yīng)體系：上下游引物（10mmol/L）各0.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）2μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水16.25μL，模板1μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，94℃45s、60℃90s、72℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過紫外成像進(jìn)行檢測；同時(shí)以上述程序擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌等菌株的基因組DNA，驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性。

1.2.3.2 單重PCR靈敏度檢測 分別挑取3種細(xì)菌（以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌CMCC51572和腸出血性大腸桿菌O157∶H7 ATCC43888為例）于滅菌生理鹽水中制成菌懸液，用比濁儀測試其濃度至108CFU/mL，然后用滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋，使菌液濃度為108～100CFU/mL，分別提取DNA后，按上述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析單重PCR擴(kuò)增的敏感性。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)

1.2.4.1 多重PCR反應(yīng)的建立及產(chǎn)物鑒定 將沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的基因組DNA進(jìn)行組合作為模板，采用1.2.3.1的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，并用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶，送往生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4.2 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)流程如下所示：

a.單因素實(shí)驗(yàn)：對引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個(gè)因素設(shè)計(jì)7個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定各因素的適宜水平范圍：引物添加量：上下游引物（10μmol/L）依次各加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；dNTP（2.5mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；Taq酶添加量：依次加入0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40μL。引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個(gè)因素的固定水平取7個(gè)水平的中間值，分別為0.4、2.0、2.0、0.25μL。

b.正交實(shí)驗(yàn)：單因素實(shí)驗(yàn)確定的最佳水平并不能代表整個(gè)反應(yīng)體系的最佳組合，不同的組合方式也可能對反應(yīng)體系產(chǎn)生影響。本研究選取單因素實(shí)驗(yàn)確定的各因素的3個(gè)最佳水平，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)表（見表3）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 L9（34）實(shí)驗(yàn)方案Table 3 The project of L9（34）experiment

1.2.4.3 退火溫度優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，對PCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選，依次設(shè)為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64℃，從中確定最佳退火溫度。

1.2.4.4 多重PCR靈敏度 取三種菌108～100CFU/mL各相同濃度的菌液等量混合，制成濃度為108～ 100CFU/mL的混合菌懸液，分別提取各稀釋度的基因組DNA，按最優(yōu)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 人工染菌 取經(jīng)國標(biāo)驗(yàn)證不含本研究的三種食源性致病菌的奶粉25g，加入225mL滅菌生理鹽水均質(zhì)，分別取三種菌過夜培養(yǎng)后的等濃度菌液各1mL加入7mL奶粉勻漿中混勻，然后以均質(zhì)液作為稀釋液進(jìn)行10倍稀釋，制成108～100CFU/mL的菌懸液，分別提取基因組DNA，按最優(yōu)多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR反應(yīng)

2.1.1 單重PCR擴(kuò)增及引物特異性驗(yàn)證 3株沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌14028、都柏林沙門氏菌50761、布倫登盧普沙門氏菌H9812）、2株志賀氏菌（福氏志賀氏菌51572、宋內(nèi)志賀氏菌51592）和2株腸出血性大腸桿菌O157∶H7（腸出血性大腸桿菌O157∶H7 43888、腸出血性大腸桿菌O157∶H7 43889）的PCR擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，分別得到長度為495、620、252bp的目的片段，片段符合預(yù)期產(chǎn)物大小。其余9株菌株呈陰性，且無非特異性條帶，表明本研究設(shè)計(jì)的3對引物特異性較好。

圖1 單重PCR擴(kuò)增結(jié)果及引物特異性驗(yàn)證Fig.1 The result of single PCR amplification and specificity of the primers

2.1.2 單重PCR擴(kuò)增敏感性分析 由圖2可知，單重PCR檢測沙門氏菌的靈敏度達(dá)104CFU/mL，志賀氏菌的靈敏度達(dá)103CFU/mL，腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度達(dá)104CFU/mL。

2.2 多重PCR反應(yīng)

2.2.1 多重PCR反應(yīng)的建立及產(chǎn)物鑒定結(jié)果 將三種食源性致病菌的基因組DNA組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能得到目的片段，且相應(yīng)的目的條帶清晰，未發(fā)生交叉影響，表明本研設(shè)計(jì)三對引物可用于進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；將目的條帶回收后測序，測序結(jié)果表明，沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7的擴(kuò)增序列與Genbank中公布的基因序列的同源性均達(dá)98%以上，從而證實(shí)PCR產(chǎn)物確為目的產(chǎn)物。

圖2 單重PCR檢測三種致病菌的靈敏度Fig.2 Detection sensitivity of single PCR for three pathogens

圖3 多重PCR反應(yīng)的建立Fig.3 Establishment of multiplex PCR

2.2.2 多重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3），引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個(gè)因素的3個(gè)適宜水平確定如下：引物（10mmol/L）適宜添加量：上下游引物各添加0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）適宜添加量：1.5、2.0、2.5μL；dNTP（2.5mmol/L each）適宜添加量：依次加入0.5、1.0、1.5μL；Taq酶適宜添加量：依次加入0.15、0.20、0.25μL。

圖4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of single-Factor experiment

2.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的4因素3水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，由圖5可見，在9組反應(yīng)體系中，由于引物、Mg2+、dNTP、酶4個(gè)因素添加量組合的不同，擴(kuò)增效果出現(xiàn)了顯著差異，其中第8泳道效果最佳，因此，25μL多重PCR最佳反應(yīng)體系確定為：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水12.55μL，模板各1μL。

圖5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系結(jié)果Fig.5 Optimization of multiplex PCR by orthogonal experiment design

2.2.3 最佳退火溫度 如圖6所示，選擇55～64℃進(jìn)行溫度梯度PCR，均能得到目的條帶，其中第3泳道的條帶最亮，因此選擇57℃作為本研究的最佳退火溫度。

圖6 最佳退火溫度的選擇Fig.6 Optimization of annealing temperature

2.2.4 多重PCR靈敏度檢測 由圖7可見，多重PCR同時(shí)檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度為104CFU/mL。一般而言，多重PCR的檢測靈敏度低于單重PCR的靈敏度，因?yàn)樵诙嘀豍CR反應(yīng)體系中，模板與引物的結(jié)合幾率可能隨引物、模板的種類和添加量的增加而降低[18]，但本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出反應(yīng)體系中各因素的最佳配比，有效地提高了模板與引物的結(jié)合效率，從而建立了與單重PCR靈敏度相當(dāng)?shù)亩嘀豍CR反應(yīng)。

圖7 多重PCR同時(shí)檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度

2.3 人工染菌

圖8 牛乳樣品人工染菌的檢測靈敏度Fig.8 Detection sensitivity of artificial pollution

由圖8可見，采用本研究建立的多重PCR方法檢測人工污染奶粉中的三種致病菌，可得到清晰、分明的條帶，檢出限為106CFU/mL，比沒有食品介質(zhì)的多重PCR靈敏度低2個(gè)數(shù)量級，這是因?yàn)槭称分械某煞质謴?fù)雜，有些成為PCR抑制因素，可能降低PCR檢測的靈敏度，有研究表明脂肪是導(dǎo)致PCR檢測靈敏度下降的因素之一[19]。

3 結(jié)論與討論

多重PCR是以單重PCR為基礎(chǔ)發(fā)展而來的檢測技術(shù)，該技術(shù)不僅可實(shí)現(xiàn)對多種致病菌同時(shí)進(jìn)行鑒定，還可對同一致病菌不同耐藥性[20-22]或血清型[23]進(jìn)行檢測。到目前為止，多重PCR因其高效、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于食源性致病菌的檢測中。然而，多重PCR并不是簡單的混合體系反應(yīng)，檢測過程中會(huì)受多種因素的影響，首先，多重PCR的引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，Settanni L[24]通過實(shí)驗(yàn)表明為了確保一對引物只能特異性擴(kuò)增出唯一的產(chǎn)物，引物設(shè)計(jì)應(yīng)更長、解鏈溫度（Tm）應(yīng)更高。本研究選取編碼沙門氏菌侵襲蛋白的invA基因、編碼志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖膇paH基因及編碼大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因作為目的基因，結(jié)果顯示引物特異性較好；其次，引物、dNTP、Mg2+、Taq酶、退火溫度等是影響PCR的重要因素，多重PCR體系因存在多對引物、多個(gè)模板而更加復(fù)雜，鑒于此，本研究結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)建立了多重PCR的最佳反應(yīng)體系（25μL）：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水12.55μL，三種細(xì)菌的模板DNA各1μL，經(jīng)驗(yàn)證該反應(yīng)的特異性較好。但相比于其他PCR反應(yīng)，本研究中的單重PCR及多重PCR的靈敏度相對較低，主要影響因素可能是模板，本研究采用試劑盒法提取基因組DNA，得到的模板純度高，但量少，且因客觀條件限制，不能對模板濃度進(jìn)行測定，無法摸索最適反應(yīng)濃度，可能對反應(yīng)靈敏度造成了影響。后續(xù)研究中可在模板提取的最后一步適當(dāng)少加入TE溶液溶解，以提高DNA模板的濃度；也可采用多種基因組提取方法，并進(jìn)行效果對比；另外，在確定模板濃度的基礎(chǔ)上，可將其加入到單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)中，尋找反應(yīng)各因素的最佳配比。此外，本研究所確立的多重PCR體系可直接從人工污染的奶粉中檢測出沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7 3種致病菌，從樣品處理到檢測結(jié)束僅需5h左右，但靈敏度降低了兩個(gè)數(shù)量級，主要是由于樣品中存在諸多干擾成分，如脂肪、多糖、蛋白質(zhì)等均會(huì)影響多重PCR的檢測靈敏度，可通過對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)后再進(jìn)行多重PCR來解決這一問題[25-26]。在后續(xù)的研究中，我們也將進(jìn)一步探索提高檢測靈敏度的途徑，以期建立更加高效、穩(wěn)定、靈敏的多重PCR方法。

本研究建立的多重PCR體系可同時(shí)檢測沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7，具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為食源性致病菌的快速篩查提供了重要的技術(shù)支持。

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Establishment of a multiplex PCR detection method for three foodborne pathogens

SHU Chang，JIANG Chen-lu，ZHONG Ci-ping，LI Lin*
（College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Objective：To establish a rapid multiplex polymerase chain reaction（PCR）method for the simultaneous detection of Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.Methods：Three pairs of primers had been designed based on the invA gene in Salmonella spp.，ipaH gene in Shigella spp. and uidA gene in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7，single-factor experiment and L9（34）orthogonal experiment were used to optimize multiplex PCR amplification system，and the sensitivity of multiplex PCR was also analyzed.Results：Fragments of 495，620，252bp were obtained respectively.Under the optimized condition，the detection sensitivity of multiplex PCR for three pathogens was 104CFU/mL.This method had been applied to artificial experiment，the result was accurate and steady，which could be obtained within 5h. Conclusion：A simple，specific and sensitive multiplex PCR method had been established and it was valuable for rapid monitoring and diagnosis for Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.

foodborne pathogens；multiplex polymerase chain reaction（PCR）；Salmonella spp.；Shigella spp.；Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.001

2013－10－09 *通訊聯(lián)系人

舒暢（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。