王金玲，張洪超，2，趙鳳艷，呂長(zhǎng)山

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginous)又名膠凍樣芽孢桿菌，國(guó)內(nèi)通常稱之為硅酸鹽細(xì)菌［1－2］。農(nóng)業(yè)上，膠質(zhì)芽孢桿菌具有解鉀、溶磷作用以及易形成根系優(yōu)勢(shì)種特性［3－5］，是目前我國(guó)微生物肥料產(chǎn)品中較為重要的一種。工業(yè)方面，膠質(zhì)芽孢桿菌在無(wú)氮培養(yǎng)基或較大的C/N培養(yǎng)基中易產(chǎn)生顯著的胞外多糖莢膜，利用這種多糖的絮凝作用生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)明顯的微生物絮凝劑前景廣闊［6－7］。冶金工業(yè)上，膠質(zhì)芽孢桿菌可應(yīng)用于細(xì)菌淋濾和改進(jìn)某些礦物材料的特性［8］，尤其對(duì)低品位礦物的開(kāi)發(fā)以及回收利用某些有用金屬具有良好的前景。養(yǎng)殖業(yè)方面，膠質(zhì)芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等，可用作飼料補(bǔ)充物，提高飼料的價(jià)值［9］。因此提高膠質(zhì)芽孢桿菌的活菌或芽孢數(shù)量與質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，考察了發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)孢量的影響，以期為膠質(zhì)芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginous) 購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種中心，CGMCC1.0910，經(jīng)紫外誘變處理，本實(shí)驗(yàn)室保存;乳糖、蔗糖、硫酸銨、硫酸錳、磷酸氫二鈉、碳酸鈣、氯化鐵、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純;蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，生物試劑。

SYQ－DSX－280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;ZD－85恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;HZQ－X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;DH－6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;XW－80A旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;XB－K－25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司;XSZ－4G雙目顯微鏡 北京聯(lián)合科儀科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:亞歷氏硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，蔗糖5g;磷酸氫二鈉2g;七水硫酸鎂0.5g;氯化鐵0.005g;碳酸鈣0.1g;土壤礦物，取耕層土加入20%鹽酸(耕層土∶鹽酸 =1∶10)煮沸30min，蒸餾水洗至無(wú)氯離子，過(guò)100 目篩［10］，1.0g;瓊脂30g;蒸餾水1000mL;pH7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:蔗糖10g;磷酸氫二鉀0.5g;七水硫酸鎂0.5g;碳酸鈣1g;蒸餾水1000mL;pH7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖21.57g;復(fù)合氮源2.6g;硫酸錳0.21g;磷酸氫二鉀1.5g;七水硫酸鎂1.2g;蒸餾水1000mL;pH7.5。其中，復(fù)合氮源質(zhì)量比為硫酸銨∶蛋白胨 =3∶1。

1.2.2 培養(yǎng)方法 菌種活化:將保存的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，32℃活化24h。

種子搖瓶培養(yǎng):用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥，接入裝有種子培養(yǎng)基 35mL的 250mL三角瓶中，32℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)20h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL，32℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，然后變溫培養(yǎng)16h。

1.2.3 芽孢計(jì)數(shù)法 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因素與組合的優(yōu)劣比較采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法［11］，計(jì)數(shù)前將菌液在80℃水浴槽中熱處理15min。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)條件中分別考察接種量、裝液量、發(fā)酵后期溫度、碳酸鈣用量、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，每個(gè)因素選取7個(gè)水平，每實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Coding list of factors and levels in single factor experiments

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇影響較大的4個(gè)因素，確定各因素的中心水平并進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表2。

本刊被中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)核心期刊數(shù)據(jù)庫(kù)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)等全文收錄。凡同意本刊刊用其稿件者，如無(wú)特別說(shuō)明，即視為同時(shí)同意本刊擁有對(duì)稿件刊發(fā)后的網(wǎng)絡(luò)出版權(quán)（本刊所付稿酬已包含網(wǎng)絡(luò)出版稿酬）。如有特別說(shuō)明，本刊將另行酌處。

1.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在優(yōu)化所得的最佳培養(yǎng)條件下做菌體生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行驗(yàn)證并獲得最佳培養(yǎng)時(shí)間，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)中圖表繪制采用Microsoft Excel處理;正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析應(yīng)用軟件為正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table2 Factors and levels in orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響 膠質(zhì)芽孢桿菌最佳接種量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，接種量從1%增加到7%時(shí)，芽孢產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，之后隨接種量的繼續(xù)增大，芽孢產(chǎn)量反而下降。接種量增加，菌體會(huì)快速生長(zhǎng)并形成芽孢，但接種量超出一定范圍時(shí)，由于微生物之間競(jìng)爭(zhēng)生存空間與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，從而影響芽孢的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，因此實(shí)驗(yàn)中選擇7%的接種量為進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的中心水平。

圖1 接種量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of inoculated amounts on spore yield

2.1.2 后期溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響 發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，菌體生長(zhǎng)與芽孢轉(zhuǎn)化選用不同的培養(yǎng)溫度。根據(jù)對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)過(guò)程中芽孢產(chǎn)量的定期檢測(cè)，發(fā)酵的前24h采用較低的32℃，之后的溫度分別提升至34～40℃，水平間隔為1℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中適宜于芽孢形成的溫度集中于36～37℃。溫度升高，微生物新陳代謝原有的平衡被打亂，引發(fā)相關(guān)酶的活性變化，微生物生長(zhǎng)受到影響;當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，隨溫度的繼續(xù)升高，膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵所得芽孢量呈現(xiàn)下降趨勢(shì);選擇曲線峰值點(diǎn)即發(fā)酵后期溫度37℃為后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的中心值。

2.1.3 碳酸鈣對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響 膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中的pH呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，當(dāng)pH低于6.5和高于8.5均對(duì)菌體的增殖不利;有研究證實(shí)［12］，如果對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期發(fā)酵液的pH不能回升至6，則芽孢與伴孢晶體無(wú)法形成，因此控制發(fā)酵液pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程中芽孢的形成與產(chǎn)量具有較大的影響。

膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵最適起始pH為7.5，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，促進(jìn)芽孢合成，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 溫度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different temperatures on spore yield

圖3 碳酸鈣用量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of calcium carbonate amounts on spore yield

2.1.4 裝液量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響 裝液量與膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和溶氧量緊密相關(guān)，實(shí)驗(yàn)中選取30～90mL的裝液量進(jìn)行考察，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法結(jié)果如圖4所示。

圖4 裝液量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of broth volumes on spore yield

由圖4可見(jiàn)，隨著裝液量的增加，芽孢產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，后期下降趨于緩慢;這是由于裝液量在增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與溶氧量的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌體間的激烈競(jìng)爭(zhēng)，致使容器內(nèi)代謝廢物大量積累，當(dāng)超過(guò)一定量時(shí)，這種反面作用更為突出，以致于對(duì)產(chǎn)孢形成抑制作用。實(shí)驗(yàn)中選擇峰值出現(xiàn)時(shí)的裝液量60mL為中心水平。

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響 發(fā)酵過(guò)程中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速主要是作為發(fā)酵液中溶氧量的調(diào)節(jié)手段。膠質(zhì)芽孢桿菌為好氧性細(xì)菌，增大溶氧量有利于菌體的增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中選取了100～250r/min 7個(gè)轉(zhuǎn)速水平，間隔為25r/min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，在100～200r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，隨轉(zhuǎn)速的增加芽孢量明顯增加;在200～250r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，芽孢產(chǎn)量增加趨勢(shì)變緩，但明顯高于低轉(zhuǎn)速范圍的產(chǎn)孢量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速增加有利于芽孢的形成，但轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加會(huì)因摩擦作用對(duì)菌體與芽孢產(chǎn)生機(jī)械破壞作用，實(shí)際搖床培養(yǎng)條件也較少高于250r/min，因此實(shí)驗(yàn)優(yōu)選轉(zhuǎn)速固定為250r/min。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of rotate speed on spore yield

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，搖床轉(zhuǎn)速固定于250r/min，其他因素以單因素最佳值為中心進(jìn)行適當(dāng)擴(kuò)大，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素及水平的設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of the orthogonal experiment

由表3可知，影響芽孢產(chǎn)量的因素順序是:接種量＞碳酸鈣用量＞裝液量＞溫度;其中碳酸鈣用于調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的pH，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明碳酸鈣用量與接種量這兩個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效果影響較為顯著。膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)組合為A3B2C1D3，即裝液量為70mL/250mL，發(fā)酵后期溫度為37℃，接種量為5%，碳酸鈣用量為6g/1000mL。

由表4方差分析可以看出，接種量和碳酸鈣用量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響顯著，其他兩項(xiàng)的影響不顯著，此結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析結(jié)論一致。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of the results

2.3 生長(zhǎng)曲線驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以上述實(shí)驗(yàn)所得的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)芽孢數(shù)，做膠質(zhì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖6所示。經(jīng)驗(yàn)證，培養(yǎng)36h芽孢數(shù)量最大，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)顯示芽孢數(shù)量為9.3×109cfu/mL，培養(yǎng)40h芽孢數(shù)量為8.7×109cfu/mL，所得結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖6 膠質(zhì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of Bacillus mucilaginosus

3 討論

目前關(guān)于膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵的研究主要集中于提高產(chǎn)菌量［14］與抑制胞外多糖［15］的產(chǎn)生方面。不同的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)下產(chǎn)生的活菌數(shù)或者芽孢數(shù)量存在較大差異。與提高產(chǎn)菌量相比，在提高芽孢產(chǎn)量方面，復(fù)合氮源的篩選與搭配、發(fā)酵后期溫度與通氧量的調(diào)整［11］、發(fā)酵過(guò)程中pH的調(diào)整也有少量的研究［16］。吳向華和劉五星［17］對(duì)一株自行篩選的膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)條件研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)基起始 pH7.5，培養(yǎng)溫度 36℃，裝液量30mL/250mL錐形瓶;在此基礎(chǔ)上利用70L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)周期33h，芽孢量可以達(dá)到9.58×108cfu/mL;此結(jié)果與胡秀芳等人［16］的研究結(jié)果相似，后者對(duì)一株離子束誘變的膠質(zhì)芽孢桿菌進(jìn)行了培養(yǎng)條件研究，結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的理想配方為:2%淀粉、0.4% 酵母、0.1%K2HPO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.5%CaCO3，pH7.5;種子菌經(jīng)二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，按6%的接種量接入70 L發(fā)酵罐，在32℃進(jìn)行發(fā)酵，通氧量2.0～2.5vvm，培養(yǎng)周期38～42h，芽孢量可達(dá)到9.8 ×108cfu/mL。陳育如等［18］的研究結(jié)果顯示膠質(zhì)芽孢桿菌最佳的培養(yǎng)條件為，pH7、溫度36℃、轉(zhuǎn)速220r/min、裝液量50mL，細(xì)菌菌量可達(dá)10.6×108個(gè)/mL。本研究中，采用加入碳酸鈣控制發(fā)酵pH，以利于芽孢形成，同時(shí)采用變溫培養(yǎng)的方法，結(jié)果表明，培養(yǎng)36h芽孢數(shù)最大，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)顯示芽孢數(shù)量為9.3×109cfu/mL，顯著高于其他研究者，這可能與本菌株經(jīng)過(guò)紫外誘變處理有一定關(guān)系，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)與其他方法的不同也會(huì)產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)中得到的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)條件，可以為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)膠質(zhì)芽孢桿菌提供一定參考，但是要應(yīng)用到工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還需要進(jìn)一步研究放大實(shí)驗(yàn)效果，篩選通氧量，攪拌轉(zhuǎn)速等條件。

4 結(jié)論

膠質(zhì)芽孢桿菌優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)為:接種量5%，起始pH7.5，碳酸鈣用量6g/1000mL，裝液量70mL/250mL三角瓶，轉(zhuǎn)速250r/min，發(fā)酵前24h溫度為32℃，之后12h溫度37℃，最佳培養(yǎng)時(shí)間36h，所得芽孢數(shù)量為9.3×109cfu/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為膠質(zhì)芽孢桿菌工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

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