付 余，趙新淮

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

自由基和活性氧可以攻擊生物體內(nèi)的糖蛋白、核酸和脂質(zhì)，從而加速衰老并誘發(fā)癌癥、動脈粥樣硬化等一系列退行性疾?。?］。尋找天然抗氧化劑預(yù)防機(jī)體氧化損傷，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量的水解物和肽類被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化性質(zhì)，這些抗氧化肽源自植物或動物蛋白，包括米糠［2］，酪蛋白［3］，蛋黃蛋白［4］，魚肉蛋白［5］。明膠作為膠原的衍生產(chǎn)物，是從動物的結(jié)締組織或表皮組織中的膠原經(jīng)變性轉(zhuǎn)化，再經(jīng)適當(dāng)溫度提取出來的水溶性物質(zhì)，它的主要結(jié)構(gòu)與膠原相近［6］。明膠水解物是通過明膠的限制酶水解而得到的，大量研究已證實(shí)其具有良好的抗氧化活性［7－11］。然而，由于瘋牛病、口蹄疫等動物疾病以及宗教禁忌等原因，人們對陸上動物明膠產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生憂慮［12］。因此，尋找明膠的新來源成為一個(gè)迫切的課題。本研究利用具有黑龍江特色的鮭魚(俗稱大麻哈魚)魚皮明膠，經(jīng)蛋白酶水解后獲得具有抗氧化活性的明膠水解物，并研究其對H2O2誘導(dǎo)的BRL大鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)的影響，從而為鮭魚明膠的開發(fā)利用、明膠水解物抗氧化作用機(jī)制揭示提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮭魚(Oncorhynchus keta)魚皮明膠 金箭明膠有限公司;堿性蛋白酶Alcalase(118kU/mL)、中性蛋白酶(54kU/mL)、木瓜蛋白酶(28kU/g) 購自諾維信公司和國藥化學(xué)試劑公司;鄰苯二甲醛 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚 天津科密歐化學(xué)試劑公司;Triton X－100、噻唑藍(lán)(MTT)北京索萊寶科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基苯肼(DPPH)、4－L－羥脯氨酸和DMEM培養(yǎng)基 Sigma公司;BRL大鼠肝細(xì)胞 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。LDH、MDA、GSH試劑盒 碧云天生物工程研究所;其他所有試劑 均為分析純;水 雙蒸水或超純水。

UV－2401PC紫外可見分光光度計(jì) 島津公司;HF－90 CO2培養(yǎng)箱 力康公司;VD－1320潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;Model 680酶標(biāo)儀 Bio－Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮭魚皮明膠基本成分測定 蛋白質(zhì)，水分，脂肪和灰分測定分別參考GB 50010.3－2011《食品中水分的測定》，GB50010.4－2011《食品中灰分的測定》，GB 50010.5－2011《食品中蛋白質(zhì)的測定》和GB50010.7－2011《食品中脂肪的測定》。4－羥脯氨酸含量測定根據(jù)Edwards(1980)方法［13］，略有修改。

1.2.2 明膠水解物的制備 配制濃度為5%(w/w)的明膠溶液。每種蛋白酶的最適條件如下:堿性蛋白酶(pH8.5，55℃)，添加量為 1(水解時(shí)間 1、7h)和10kU/g(水解時(shí)間7h)。木瓜蛋白酶(pH6.0，60℃)，添加量為0.5(水解時(shí)間1h)和1kU/g(水解時(shí)間2、7h)。中性蛋白酶(pH7.0，45℃)，添加量為10kU/g(水解時(shí)間7h)。反應(yīng)結(jié)束后，迅速置于沸水浴15min。冷卻至室溫后，5000r/min離心20min，取上清液，真空冷凍干燥后于－20℃保存［7－11］。

1.2.3 明膠水解物的水解度(DH)測定

1.2.3.1 蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法［14］。

1.2.3.2 游離氨基含量測定 鄰苯二甲醛(OPA) 法［15］。

取3mL水解物溶液與同體積OPA試劑混合并開始計(jì)時(shí)，5min后在分光光度計(jì)上測定340nm下吸光值。計(jì)算公式如下:

DH(%)=［水解物游離氨基含量(μmol/mL)/(5.55×水解物氮含量(mg/mL)－0.39(mmol/g)］÷11.1(mmol/g)×100

其中，0.39mmol/g為測定出的明膠的游離氨基含量;11.1mmol/g為明膠的肽鍵含量;5.55為明膠氮含量換算系數(shù)。

1.2.4 抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH自由基的清除活性 參考Nsimba等方法［16］。配制20μmol/L DPPH 乙醇溶液，存于暗處待用。1mL DPPH溶液與2mL的樣品溶液混合，置于暗處，室溫反應(yīng)30min，517nm處測定吸光值。以無水乙醇作為空白對照，每組實(shí)驗(yàn)平行三次。計(jì)算公式如下:

其中，A0為空白樣吸光值;A1為樣品吸光值。

1.2.4.2 羥自由基清除活性 參考 Li等方法［17］。2mL溶于0.15mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液的鄰二氮菲(0.75mmol/L)與2mL溶于0.15mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液的 FeSO4(0.75mmol/L)充分混合，加入1mL樣品和1mL 0.01%的 H2O2?；旌衔镌?7℃反應(yīng)60min，536nm下測定吸光值。計(jì)算公式如下:

其中，AS，樣品吸光值;A1，鄰二氮菲，F(xiàn)eSO4和H2O2的對照溶液的吸光值;A0，鄰二氮菲和FeSO4的空白溶液的吸光值。

1.2.4.3 超氧陰離子清除活性 采用鄰苯三酚自氧化方法［18］。1.0mL 樣品與 1.8mL 50mmol/L Tris－HCl(pH8.2)緩沖液混合。25℃下反應(yīng) 10min，加入0.1mL 10mmol/L的鄰苯三酚。320nm處測定吸光值，每0.5min讀一次數(shù)，讀數(shù)4min。樣品的鄰苯三酚氧化速率由吸收率曲線的斜率(ΔA1)計(jì)算?？瞻奏彵饺幼匝趸俾释ㄟ^雙蒸水代替樣品(ΔA0)來測定。計(jì)算公式如下:

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)，細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度種于96孔板(每孔200μL)、1×105個(gè)細(xì)胞/mL密度種于24孔板(每孔500μL)，細(xì)胞貼壁后待用。

1.2.7 明膠水解物對BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(MTT法) 待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度(0.5、1、2mg/mL)不同水解度的鮭魚魚皮明膠水解物。作用24h后，加入 H2O2誘導(dǎo)損傷，條件為5mmol/L，1.5h。結(jié)束后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加入200μL DMSO，振蕩混勻，酶標(biāo)儀上檢測光密度(OD)值，波長490nm［19］。加入明膠水解物組為處理組，未加入明膠水解物和H2O2組為陰性對照組，僅加入H2O2組為損傷模型組。計(jì)算公式為:

1.2.6 明膠水解物對BRL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA和GSH的含量影響 使用碧云天生物工程研究所LDH、MDA、GSH試劑盒測定，方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以Means±SD表示。采用SPSS13.0軟件中One－way ANOVA及Duncan多重比較分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠水解物的制備

采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶制備的明膠水解物，分別定義為AGH1－3或 PGH1－3，而采用中性蛋白酶制備的水解物定義為NGH。7個(gè)明膠水解物的水解度在4.7%～13.5%，制備條件如表1所示。由于蛋白水解物的抗氧化活性大小與水解度有關(guān)［7］，因此，可以評價(jià)抗氧化活性不同的明膠水解物對大鼠肝細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用，以及抗氧化活性與細(xì)胞保護(hù)作用之間的關(guān)聯(lián)。

表1 7個(gè)明膠水解物的水解條件及水解度Table1 The conditions of hydrolysis and DH of seven hydrolysates

2.2 明膠水解物抗氧化活性

2.2.1 對DPPH自由基清除能力 明膠水解物對DPPH自由基有清除作用。它對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增強(qiáng)(圖1)，呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。木瓜酶水解物、堿性酶水解物和中性酶水解物在添加量為64mg/mL時(shí)達(dá)到最大清除率，分別為59.0%、56.8%、61.3%。在相同濃度下，對DPPH自由基的清除率隨明膠水解物水解度的增高而逐漸增強(qiáng)。這一點(diǎn)與文獻(xiàn)結(jié)果［20］一致。

圖1 明膠水解物清除DPPH自由基的能力Fig.1 The ability of scanvaging DPPH radicals of gelatin hydrolysates

2.2.2 對羥自由基清除能力 羥自由基屬于活性氧的一種，是最活潑的自由基，可以引起生物大分子損傷。因此，研究明膠水解物對羥自由基的清除能力對抗氧化性研究具有重要意義。圖2數(shù)據(jù)表明，明膠水解物對羥自由基的清除率隨濃度、水解度的增加而增強(qiáng)，并呈劑量依賴性關(guān)系。然而，水解度最大的明膠水解物AGH3在最大濃度時(shí)，其清除率僅為33.3%，這說明明膠水解物對羥自由基清除能力較弱。

圖2 明膠水解物清除羥自由基的能力Fig.2 The ability of scanvaging hydroxyl free radical of gelatin hydrolysates

2.2.3 對超氧陰離子清除能力 超氧陰離子能加速脂肪氧化和生物體衰老，誘發(fā)炎癥或癌癥等疾病。鄰苯三酚自氧化法常用于測定超氧陰離子的清除能力。由圖3的數(shù)據(jù)可以看出，明膠水解物對超氧陰離子的清除率隨質(zhì)量濃度的增加和水解度的加大而呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，并成顯著的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為64mg/mL時(shí)，PGH3最大的清除率為96.5%?？梢娒髂z水解物對超氧陰離子具有極強(qiáng)的清除能力。

圖3 明膠水解物清除超氧陰離子的能力Fig.3 The ability of scanvaging superoxide anion radicals of gelatin hydrolysates

2.3 明膠水解物對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的重要細(xì)胞器，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，造成線粒體的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21］。表2數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)肝細(xì)胞與H2O2作用2h后，細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化損傷，細(xì)胞存活率顯著下降至29.0%(p＜0.05)。處理組中，當(dāng)AGH3在2mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率提高至56.3%，而PGH2在1mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率僅提高至30.8%。結(jié)果表明明膠水解物預(yù)先與細(xì)胞作用24h，再加入 H2O2氧化損傷2h后，細(xì)胞存活率總體上可顯著提高(p＜0.05)。

細(xì)胞由于氧化損傷，細(xì)胞膜的完整性受到破壞，乳酸脫氫酶(LDH)釋放至培養(yǎng)液，其滲出量可間接反映細(xì)胞的損傷程度［22］。如表2所示，當(dāng)肝細(xì)胞與H2O2作用2h后，培養(yǎng)液內(nèi)的LDH含量達(dá)到575.0U/L，這表明細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化損傷。然而，明膠水解物預(yù)先作用24h后，可顯著降低LDH的滲出量(p＜0.05)。處理組中，添加AGH3在2mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液中的LDH滲出量降低至375.7U/L(p＜0.05)。

丙二醛(MDA)的生成量是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，MDA能夠破壞蛋白質(zhì)等生物大分子，造成機(jī)體多種疾病的發(fā)生［23］。因此，測定H2O2損傷的肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量可以鑒定明膠水解物對細(xì)胞抗氧化的保護(hù)作用。表2數(shù)據(jù)顯示，正常組細(xì)胞內(nèi)MDA含量僅為9.1nmol/mg蛋白，而當(dāng)H2O2損傷細(xì)胞2h后，MDA含量達(dá)到29.0nmol/mg蛋白(p＜0.05)。當(dāng)明膠水解物預(yù)先作用24h后，可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)的MDA生成量(p＜0.05)，添加AGH3為2mg/mL的培養(yǎng)液中的MDA含量達(dá)到17.6nmol/mg蛋白。

表2 不同濃度明膠水解物對H2O2誘導(dǎo)損傷肝細(xì)胞的影響Table2 The impacts of different gelatin hydrolysates on H2O2－induced the oxidative stress in BRL cells

谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡主要的非酶調(diào)節(jié)劑，當(dāng)細(xì)胞受到氧化脅迫時(shí)，GSH的含量迅速降低［24］。從表2結(jié)果可以看出，當(dāng)BRL細(xì)胞與H2O2作用2h后，細(xì)胞內(nèi)的GSH含量顯著下降至56.8nmol/mg蛋白(p＜0.05)。而BRL細(xì)胞與0.5mg/mL的明膠水解物作用2h后，細(xì)胞內(nèi)的GSH含量升高不顯著(p＞0.05)。這可能是由于細(xì)胞在應(yīng)對氧化損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶的失活造成的［24］。

2.4 明膠水解物的抗氧化活性與細(xì)胞保護(hù)作用之間的相關(guān)性

由前述的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，明膠水解物具有不同的抗氧化活性，而且對大鼠肝細(xì)胞顯示出不同的保護(hù)作用。因此有必要進(jìn)一步剖析明膠水解物抗氧化性質(zhì)與細(xì)胞保護(hù)作用之間的關(guān)聯(lián)性。表3的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率、LDH滲出量和MDA生成量與明膠水解物的抗氧化活性大小之間具有明顯的相關(guān)性。其中，LDH滲出量、MDA生成量與抗氧化活性大小呈負(fù)相關(guān)(r＜0)，細(xì)胞存活率與抗氧化活性大小呈正相關(guān)(r＞0)。然而，當(dāng)明膠水解物濃度為1.0mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH含量水平與體外化學(xué)評價(jià)指標(biāo)間不具有明顯的相關(guān)性(p＞0.05)?？傮w上，明膠水解物抗氧化性在細(xì)胞體系中評價(jià)結(jié)果與化學(xué)方法評價(jià)結(jié)果具有一致性。因此，鮭魚皮明膠水解物對BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，與體外清除自由基能力存在一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

3.1 本研究利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解明膠，制備出水解度在4.7%到13.5%的7個(gè)明膠水解物。通過測定其對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子指標(biāo)的清除活性，表明明膠水解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且抗氧化活性隨著明膠水解物水解度的增大呈增強(qiáng)趨勢。

3.2 通過大鼠BRL肝細(xì)胞損傷模型，證明明膠水解物對大鼠肝細(xì)胞的H2O2誘導(dǎo)損傷具有保護(hù)作用?？梢燥@著的增加細(xì)胞存活率，降低LDH滲出量和胞內(nèi)MDA生成量;不過，細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化不顯著。明膠水解物對細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，7個(gè)明膠水解物對H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(細(xì)胞存活率增加，以及LDH滲出量和MDA生成量降低)，與水解物的體外抗氧化活性存在很好的相關(guān)性。因此可以推測，鮭魚皮明膠水解物對H2O2誘導(dǎo)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用方式，與其清除自由基相關(guān)。

表3 氧化損傷體系中指標(biāo)與體外化學(xué)評價(jià)指標(biāo)間相關(guān)性Table3 Correlation between the celluar indices of oxidative stress and indices of chemical evaluation in vitro

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