夏靜芬，張仕榜，金婷婷，汪財生

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315100)

鄰苯二甲酸酯類(Phthalate esters，PAEs)又稱酞酸酯，主要作為增塑劑被廣泛應用于塑料工業(yè)中。但它與聚烯烴類塑料分子之間并不是以化學鍵結合，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨立的化學性質，因此，很容易從塑料中溶出和蒸發(fā)，從而轉入空氣、水體、底質和生物等環(huán)境載體中，且持久存在而不易分解。近年來的研究表明PAEs是一類環(huán)境激素類物質，可干擾人體激素的分泌，具有一般毒性和致畸、致突變性［1－2］。鑒于 PAEs毒性和普遍性，建立快速準確檢測樣品中PAEs含量的方法已成為研究的熱點。目前，國內外測定PAEs的主要方法有氣相色譜法［3－4］、氣質聯用法［5－6］、高效液相色譜法［7－8］以及表面增強拉曼光譜［9］等。熒光光譜法測定PAEs則少有報道，且多數工作集中在單因素優(yōu)化方面［10－11］，而在 PAEs 的熒光反應過程中各因素往往是相互影響的。響應面法基于非線性模式進行設計和研究，將體系的響應作為多個因素的函數，并運用圖形和建模技術將這種函數關系顯示出來，具有精度高、預測性好等優(yōu)點，已被廣泛用于同時存在多因素影響的實驗優(yōu)化等方面，但在熒光法測定PAEs總量的優(yōu)化研究方面還未見報道。貝類屬于濾食性生物，移動性較差，生活方式固定，當水環(huán)境受到污染后，在濾食餌料時不可避免地從水中吸入鄰苯二甲酸酯等有害物質。本文以螺螄為研究對象，并通過響應面法對影響熒光法測定PAEs的因素水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，這對于開展貝類生物體中PAEs安全檢測工作具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺螄樣品 于2011年11月至12月購于寧波各大菜場;標準物質鄰苯二甲酸二甲酯(DMP，99%)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP，99%)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP，99.5%)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP，98%)、鄰苯二甲酸(2－乙基己基)酯(DEHP，99%)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP，99%) 均購自國藥集團化學試劑有限公司;正己烷、二氯甲烷、甲醇 色譜純;蒸餾水二次重蒸水;其他試劑 均為市售分析純。

F－4500熒光分光光度計 日本日立公司;pHS23TC精密數顯酸度計 上海天達儀器有限公司;KL512數控恒溫水浴氮吹儀 北京康林科技有限責任公司;KS－1000T超聲波清洗機 寧波海曙科生超聲設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集及處理 將螺絲去殼后，準確稱取5.0g左右螺絲肉，用生理鹽水清洗，置于高速組織搗碎機中搗碎，并移入50mL不銹鋼離心管中，于4℃，8000r/min條件下離心10min。棄清液，同法2次，濾渣加入8mL 1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液，置于1000W的超聲波清洗機中超聲提取30min，而后在4℃，160r/min條件下搖床振蕩1h。取出后，在4℃，8000r/min條件下離心10min，重復萃取三次。取上清液置于比色管中，經氮吹至干。加入2mL甲醇，在小型超聲提取儀中超聲溶解0.5h，經0.45μm有機濾膜過濾后待測。按上述操作步驟同時用蒸餾水制備空白樣品。

1.2.2 單因素實驗 分別以NaOH溶液濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10mol/L)，Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，5.7 ×10－3mol/L 的 EDTA－Fe(Ⅱ)(0.1、0.3、0.5、0.7、1mL)和 3% 的 H2O2(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL)用量為單因素，考查 4 個因素對熒光反應強度的影響。熒光法反應操作流程如下:取0.2mL的鄰苯二甲酸酯工作液于20mL比色管中，加入0.5mL一定濃度的NaOH溶液，稀釋至10mL，70℃水浴加熱15min后取出，冷卻至室溫，加1∶1 HCl調至中性，依次加入7mL緩沖溶液，EDTA－Fe(Ⅱ)溶液，H2O2溶液，定容至20mL，室溫反應2h(從加入EDTA－Fe(Ⅱ)溶液搖勻后計時)后，測定體系的熒光強度。同時以0.2mL的甲醇為空白對照。后續(xù)因素的實驗將前一因素的較佳條件代入以置換初始條件。

1.2.3 響應面法優(yōu)化熒光反應條件 在單因素實驗的基礎上，確定Box－behnken設計的自變量，以熒光強度為響應值，通過響應曲面優(yōu)化熒光反應條件，設計因素及水平見表1。

表1 設計因素及水平表Table1 Levels and factors in Box－Benhnken experimental design

2 結果與分析

2.1 產物的最佳檢測波長

鄰苯二甲酸酯在堿性條件下水解生成鄰苯二甲酸鈉，鄰苯二甲酸鈉在Fe(Ⅱ)和H2O2作用下生成具有熒光的羥基鄰苯二甲酸鈉。按1.2.2的方法分別對DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP 和 DOP 標準溶液進行熒光激發(fā)和發(fā)射掃描，掃描結果表明:不同類型的鄰苯二甲酸酯水解后的反應產物的λex和λem非常接近，最大激發(fā)波長300nm，最大發(fā)射波長410nm。

2.2 熒光反應單因素影響研究

色譜分析表明螺類樣品體內DBP含量較高［12］，本實驗即以DBP標準溶液為例進行單因素優(yōu)化和響應面模型預測的研究。PAEs熒光反應包括酯水解生成鄰苯二甲酸鈉和水解產物通過Fenton反應生成具有熒光的羥基鄰苯二甲酸鈉兩個過程，水解過程中NaOH溶液的濃度，Fenton反應緩沖溶液的pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量是影響產物熒光強度的最主要因素。實驗以產物的熒光強度為指標，考查了這四個因素的影響。

2.2.1 NaOH溶液的濃度的影響 結果見圖1。從圖1可知，在控制緩沖液pH為7.0，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量分別為0.5、1.5mL的條件下，隨著NaOH溶液濃度升高，反應物熒光強度增強，當NaOH溶液的濃度為5.0mol/L時，鄰苯二甲酸酯水解最完全，熒光強度最高，繼續(xù)升高 NaOH濃度，熒光強度反而下降。

圖1 NaOH溶液的濃度對熒光強度的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on fluorescence intensity

2.2.2 Fenton反應緩沖溶液的pH的影響 結果見圖2。不同pH的緩沖溶液對反應體系熒光強度影響結果表明，當pH接近中性條件時，熒光強度大且穩(wěn)定;pH低于7時，熒光強度明顯減弱;隨著pH的升高，Fe(Ⅱ)生成沉淀，熒光值也出現下降趨勢。

2.2.3 EDTA－Fe(Ⅱ)濃度的影響 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量對反應體系熒光強度影響見圖3，由圖3可以看出隨著EDTA－Fe(Ⅱ)溶液用量增加，反應后產物熒光強度顯著增強，當加入0.5mL 5.7×10－3mol/L的EDTA－Fe(Ⅱ)溶液時，產物熒光響應值最高，之后有所下降趨勢。

2.2.4 H2O2用量的影響 結果見圖4。不同H2O2量對反應體系產生熒光強度影響與EDTA－Fe(Ⅱ)不同，一開始熒光反應強度隨H2O2用量的增大而增大;當H2O2的用量大于1.0～1.5mL后，熒光值穩(wěn)定;繼續(xù)增加H2O2用量，熒光值基本不變。

圖2 緩沖溶液的pH對熒光強度的影響Fig.2 Effect of pH on fluorescence intensity

圖3 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量對熒光強度的影響Fig.3 Effect of EDTA－Fe(Ⅱ)volume on fluorescence intensity

圖4 H2O2用量對熒光強度的影響Fig.4 Effect of H2O2volumes on fluorescence intensity

2.3 響應曲面優(yōu)化反應條件

為探索熒光反應體系中各條件間的交互作用，在單因素實驗的基礎上采用響應曲面分析法研究NaOH溶液濃度，緩沖液pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和 H2O2用量4因素對PAEs在Fenton反應體系中產生的熒光強度的影響。實驗以反應體系產生的熒光強度為響應值進行Box－Behnken設計實驗，實驗方案及結果見表2。

采用design expert7.0軟件對表2的熒光強度和影響因素進行多元回歸擬合，得到熒光強度對自變量A、B、C、D的二次多項回歸方程:

對模型進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

表2 熒光強度響應面實驗設計及結果Table2 Design and experimental results of RSM

從響應面模型方差分析表可知，模型F值為23.35，概率p＜0.0001，表明模型極顯著;失擬項p=0.1544＞0.05，表明由誤差引起的失擬不顯著;模型的確定系數值為0.95894，調整校正確定系數為0.91788，兩者具有一致性，說明方程的因變量與全體自變量間線性關系明顯;模型的變異系數值為8.10%，說明模型的精密度較好。

回歸模型各項的方差分析結果還表明，在所選的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序為:D＞C＞B＞A，即H2O2用量＞EDTA－Fe(Ⅱ)用量＞緩沖溶液的pH＞NaOH溶液的濃度，其中B、C、D均為高度顯著項，A為顯著項。交互項BC影響高度顯著，其三維響應面圖見圖5，圖中橫坐標分別為Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液的 pH與 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液加入量兩個變量，3%的H2O2加入量及NaOH溶液的濃度變量已處于反應體系產生熒光強度為最高值時的值。BC影響極顯著BD、CD影響顯著，AB、AC、AD 影響不顯著;在二次項中 A2、B2、C2和 D2的 p值均小于0.01，表明所有二次項差異高度顯著。二次回歸模型計算結果表明:在本實驗設定的變量范圍內，鄰苯二甲酸酯類物質熒光反應體系產生最高熒光強度值162.3，此時最優(yōu)化的各項目變量分別為:加入 0.5mL NaOH溶液的濃度為 4.61mol/L、Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液的 pH為 7.09、5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量為 0.55mL、3%的H2O2需加入1.63mL。依此體系反復實驗，實際測得平均熒光強度為164.50，與模型預測值非常接近，誤差為1.36%，充分反映曲面模型有效及具有強大的分析能力，可為實際操作提供良好的指導。

表3 響應曲面二次模型的方差分析Table3 Analysis of variance for peak areas with various extraction conditions

圖5 EDTA－Fe(II)用量及緩沖液的pH交互作用對反應體系的熒光值影響的3D曲面圖Fig.5 3D contour map of the influence of EDTA－Fe(II)volume and pH on fluorescence intensity

2.4 分析方法特性

2.4.1 標準曲線 在選定的最優(yōu)實驗條件下，以不同濃度的DBP標準液濃度為橫坐標(C，10－5mol/L)，熒光值為縱坐標(F)繪制標準曲線，DBP濃度與熒光強度有良好的線性關系?；貧w方程為F=1.9935C+2.6809，相關系數r為0.9943。

2.4.2 加和性實驗 實驗分別稱取表4所列6種PAEs酯，用甲醇定容至25mL，并同法稱取各酯類混合物用甲醇定容至25mL進行加和性實驗，結果如表4所示，實驗的六種PAEs混合后濃度的測得值幾乎與其累加值相同，說明不同 PAEs的熒光值可以累加。

表4 加和性實驗結果Table4 Results of spectral additive property

2.4.3 回收率實驗 回收率實驗結果見表5，測得對照樣品濃度的平均值為31.23×10－5mol/L?；厥章史秶鸀?3.80%～106.11%，表明該方法適用于貝類樣品鄰苯二甲酸酯類的測定。

表5 回收率實驗結果Table5 Results of recovery

表6 寧波市區(qū)菜市場螺螄體內PAEs總量Table6 Analytical results of total PAEs in snails

2.5 樣品分析結果

采集寧波各區(qū)內不同菜場的螺螄，按照1.2.1方法處理后，用優(yōu)化的熒光分析條件平行測定三次，結果見表6。由表6可知，樣品測定的相對標準偏差為1.73%～6.56%。寧波不同地區(qū)菜市場中螺螄PAEs的總量在26.64～44.89mg/kg之間，表明其受到了不同程度的鄰苯二甲酸酯類的污染，分別采集的14個市場螺螄樣品間存在著差異性較大，間接表明螄螺樣品養(yǎng)殖水域中PAEs污染程度。

3 結論

通過單因素法與響應面法相結合的方法較快速、有效地得到最佳熒光反應條件為NaOH濃度4.61mol/L，Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液的 pH7.09，5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量0.55mL，3%的H2O2加入量1.63mL。在優(yōu)化條件下測定螺螄樣品PAEs總量，方法的回收率在93.80%～106.11%之間，在測定寧波市區(qū)菜市場螺螄體內PAES總量時相對標準偏差為1.73%～6.56%，所檢測螺螄中PAEs達26.64～44.89mg/kg。本實驗研究有助于建立快速檢測螺螄等貝類生物體內鄰苯二甲酸總量的方法。

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