劉 錄，陳海云，劉菲菲，姚元成，徐勝平，楊克沙，趙海云，曹建新，*

(1.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650504;2.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

辣椒(Capsicum frutescence L.)又稱辣角、辣子、番椒、秦椒，屬茄科辣椒屬植物，是人類種植的最古老的農(nóng)作物之一［1］，它具有體溫調(diào)節(jié)［2］、抗癌［3］，消炎鎮(zhèn)痛［4］等作用，不僅可以作為調(diào)味品來(lái)使用，還可作為菜肴來(lái)食用，許多人很喜歡食用。辣椒中具有辣味的物質(zhì)有十余種，其中辣椒堿(Capsaicin)、二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin)是最辣的成分，這兩種物質(zhì)的含量約占辣椒中辣味物質(zhì)的90%左右。辣味物質(zhì)含量越高，辣椒的辣味越強(qiáng)［5－6］。云南地處低緯高原地區(qū)，地理位置特殊，地形地貌復(fù)雜，海拔懸殊極大，各地氣候受海拔和地形影響大于緯度影響，往往同一地區(qū)出現(xiàn)不同氣候帶，全省具有豐富多樣的氣候類型。這種復(fù)雜多樣的地理環(huán)境和氣候條件，分布有大量的辣椒種質(zhì)資源，是我國(guó)辣椒種質(zhì)資源最為豐富的省份之一［7］。據(jù)此，本文通過(guò)高效液相的分析方法對(duì)云南省不同地區(qū)不同品種的辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量進(jìn)行分析檢測(cè)，擬建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的分析檢測(cè)方法及為從植物資源中提取辣椒堿類物質(zhì)提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒樣品采于云南省紅河、河口、丘北、景洪、江那和德宏地區(qū)，經(jīng)云南省農(nóng)科院園藝所劉發(fā)萬(wàn)副研究員鑒定;液相標(biāo)品:二氫辣椒堿，辣椒堿(純度均≥98%) 購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。

PE Series 200 LC高效液相色譜儀 美國(guó)珀金埃爾默公司;TU－1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SB－2000 EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒－托利多上海有限公司。

無(wú)水乙醇、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃和磷酸 均為分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;甲醇和乙腈 均為色譜純，購(gòu)于江蘇漢邦科技有限公司;純凈水 購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的提取 對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取［8］，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)的溶劑、提取溫度、液固比和超聲時(shí)間四個(gè)因素，并以此為據(jù)按照因素水平表1進(jìn)行四因素三水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，得到最佳提取條件，液固比:30∶1;提取溶劑:75%乙醇水溶液;提取溫度:55℃;超聲時(shí)間:50min。

表1 因素水平表Table1 The table of the factors and levels

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制 取辣椒堿和二氫辣椒堿適量，置于干燥器中過(guò)夜干燥，精密稱定各化合物，用甲醇配制成單品對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制

1.2.3.1 干辣椒樣品溶液的制備［9］將干辣椒在50℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)60目篩，稱取1.0000g于100mL容量瓶中加入30mL乙醇，用保鮮膜封口，用針扎幾個(gè)小孔，經(jīng)超聲波清洗儀于55℃下超聲提取50min，用濾紙過(guò)濾后，收集濾液，將濾渣和濾紙重新加入75%乙醇溶液25mL，超聲提取20min，再重復(fù)1次，將三次過(guò)濾收集的濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70℃下濃縮，甲醇定容至25mL，經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.3.2 新鮮辣椒樣品溶液的制備［9］新鮮辣椒用組織搗碎機(jī)搗碎，稱取5.0000g，用烘箱在50℃下烘干至恒重。制備方法同上節(jié)所述干辣椒樣品溶液的制備方法。

1.2.4 色譜條件(樣品溶液的提取;色譜條件) 色譜柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)。檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器。檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。柱溫:30℃。甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65% ～90%，0～30min)，流速 1.2mL/min。進(jìn)樣量20μL。

1.2.5 計(jì)算公式 辣椒堿、二氫辣椒堿得率為提取的辣椒堿和二氫辣椒堿的質(zhì)量與辣椒樣品質(zhì)量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)“相似相容”原理，結(jié)合辣椒堿及二氫辣椒堿的結(jié)構(gòu)及極性，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、50%乙醇、70%乙醇和無(wú)水乙醇7種溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果表明相同條件下，甲醇對(duì)辣椒堿和二氫辣椒堿的提取得率最高，四氫呋喃(THF)次之，70%乙醇溶液與THF相比略有下降，丙酮最低。但鑒于毒性和價(jià)格綜合考慮，選擇乙醇作為提取劑較適宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 2.1.1中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不同時(shí)，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率差別較大，為了找到更適宜提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)，進(jìn)一步提高得率，實(shí)驗(yàn)選取體積分?jǐn)?shù)為50%～100%的乙醇，相鄰間距為10%，重復(fù)2.1.1的提取操作，結(jié)果表明辣椒堿和二氫辣椒堿的得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈拋物線變化，在乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%附近時(shí)，達(dá)到最大。因此實(shí)驗(yàn)選擇80%的乙醇為提取劑。

2.1.3 提取溫度的選擇 實(shí)驗(yàn)中精確稱取等質(zhì)量的辣椒樣品，加入25mL濃度為80%的乙醇溶液，分別在30～70℃下，相鄰間距為 10℃，超聲輔助提取30min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至 25mL，取適量過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明辣椒堿和二氫辣椒堿的得率與超聲溫度呈拋物線變化，50℃附近提取率都達(dá)到最大，因此，辣椒堿的提取溫度控制在50℃左右為宜。

2.1.4 液固比的選擇 實(shí)驗(yàn)中精確稱取等質(zhì)量的辣椒樣品，分別按取液固比(體積:質(zhì)量)為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入濃度為 80% 的乙醇，在 50℃ 下超聲輔助提取30min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至25mL，取適量過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明隨著液固比的增大，相間傳質(zhì)速率增大，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率不斷增大，當(dāng)液固比為25∶1后，得率變化不大，綜合考慮最佳的提取液固比應(yīng)為25∶1。

2.1.5 超聲時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)中精確稱取等質(zhì)量的辣椒樣品，按液固比(V:m)為25∶1加入濃度為80%的乙醇，在50℃下分別超聲輔助提取20、30、40、50、60min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至 25mL，取適量過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明超聲時(shí)間由20min升至30min過(guò)程中，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率迅速升高，提取時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng)，得率變化不大，因此超聲提取時(shí)間確定為30min左右為宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取影響辣椒堿和二氫辣椒堿得率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液固比和超聲時(shí)間4個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化辣椒堿和二氫辣椒堿的提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，以辣椒堿和二氫辣椒堿得率分別為指標(biāo)時(shí)，適宜提取工藝都為:A1B3C3D3，由正交分析知其最優(yōu)條件均為A1B3C3D3，與正交實(shí)驗(yàn)分析所得最優(yōu)工藝條件一致，所以選擇A1B3C3D3為辣椒堿和二氫辣椒堿得率的適宜提取工藝條件，即乙醇濃度為75%、提取溫度為55℃、液固比為30∶1、超聲時(shí)間為50min。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of standard curve，detection limit and quantitation limit

2.3 超聲提取次數(shù)的確定

精確稱取等質(zhì)量的辣椒樣品5份，參照以上得出的辣椒堿和二氫辣椒堿適宜提取工藝分別提取1～5次，HPLC分析結(jié)果表明當(dāng)對(duì)辣椒樣品進(jìn)行重復(fù)提取時(shí)，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率有很大升高，但隨著提取次數(shù)的增加到3次時(shí)，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率升高不明顯，表示辣椒堿和二氫辣椒堿已經(jīng)接近完全提取，考慮工藝復(fù)雜性及經(jīng)濟(jì)性，選擇提取次數(shù)為3次。

2.4 色譜分離參數(shù)的確定

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 采用雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì)對(duì)辣椒堿和二氫辣椒堿進(jìn)行掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為190～400nm，辣椒堿和二氫辣椒堿均在 λ=280nm處有最大吸收峰，與文獻(xiàn)值一致。所以，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)λ=280nm，對(duì)辣椒堿及二氫辣椒堿進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2.4.2 流動(dòng)相的確定 為了獲得較好的分離度，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中利用8組不同流動(dòng)相系統(tǒng):乙腈－水，乙腈－1‰磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－2.5%乙酸水溶液，甲醇－1‰甲酸水溶液，甲醇－3‰甲酸水溶液，甲醇－1‰磷酸水溶液，甲醇－3‰磷酸水溶液，甲醇－水－磷酸。分別對(duì)樣品中化合物含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)比較化合物保留時(shí)間和峰型，最終選用甲醇－3‰磷酸水溶液系統(tǒng)。將供試品溶液經(jīng)HPLC進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65%～90%，0～30min)，辣椒堿和二氫辣椒堿可獲得較好的分離度。

2.5 對(duì)照品液和樣品液的色譜分離圖

取供試樣品溶液適量，參照上面所述液相方法進(jìn)行HPLC分析，記錄譜圖，如圖1所示。供試品色譜圖中辣椒堿和二氫辣椒堿的色譜峰分離度及峰形均較好，符合高效液相色譜定量分析的一般要求。

分別取辣椒堿和二氫辣椒堿對(duì)照品溶液適量，參照上面同樣的液相方法進(jìn)行HPLC分析，記錄譜圖，如圖1所示。辣椒堿和二氫辣椒堿在色譜圖中的保留時(shí)間分別為13.2、16.4min，取供試樣品溶液2份，分別加入辣椒堿和二氫辣椒堿對(duì)照品溶液，搖勻，各取適量經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾，經(jīng)HPLC分析，譜圖中對(duì)應(yīng)的色譜峰明顯增高。

圖1 混合對(duì)照品與樣品對(duì)照色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of reference substances and samples

2.6 線性關(guān)系、定量限及檢出限的考察

精密稱取辣椒堿、二氫辣椒堿各25.02mg，分別定容至25mL，都配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋使?jié)舛确謩e為0.20、0.10、0.08、0.05、0.02mg/mL。經(jīng) HPLC 分析，以對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3所示。辣椒堿和二氫辣椒堿在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上。

取各單品對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋后進(jìn)行HPLC分析，調(diào)整溶液濃度得出信噪比為3和10時(shí)，即可得到樣品的最低檢出限和定量限，辣椒堿和二氫辣椒堿的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表3所示。

2.7 精密度及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取適量配制好的混合對(duì)照品溶液，用0.45μm濾膜微過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，辣椒堿和二氫辣椒堿兩種對(duì)照品HPLC分析結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.46%和0.79%，表明儀器精密度良好，該方法精密度符合要求。

表7 新鮮辣椒中辣椒堿，二氫辣椒堿含量Table7 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in fresh chillies

表8 干辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿含量Table8 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in dry chillies

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試樣品溶液，平行測(cè)定6次，考察HPLC測(cè)定的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表4，辣椒堿和二氫辣椒堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.57%和0.86%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表4 色譜方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Stability of the experimental results of chromatographic methods

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取某一樣品溶液，每2h經(jīng)HPLC測(cè)定一次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5所示。辣椒堿和二氫辣椒堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.54%和0.63%，表明樣品在10個(gè)小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，取涮涮辣樣品，設(shè)計(jì)5組平行實(shí)驗(yàn)，每組三份分別加入0.10、0.30、0.50mL辣椒堿和二氫辣椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，記錄峰面積，按線性回歸方程計(jì)算辣椒堿和二氫辣椒堿的含量，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，平均加標(biāo)回收率在98.58%～99.81%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～0.99%。表明該方法可以滿足對(duì)辣椒樣品的分析測(cè)試要求。回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表6。

表5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Experimental results of the sample stability

表6 添加回收率的結(jié)果(n=5)Table6 Results of recovery(n=5)

2.11 不同辣椒樣品中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的測(cè)定

按照前面所述樣品溶液的制備方法以及HPLC測(cè)定方法對(duì)15種辣椒中辣椒堿，二氫辣椒堿含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表7、表8。

從表7可以看出，對(duì)于不同種新鮮辣椒，其辣椒堿和二氫辣椒堿的含量與辣椒所屬種類一致，依次為云南本地小米辣＞指天椒(外引種)＞圓錐型，圓錐形辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿含量遠(yuǎn)低于其它類型的辣椒。

從表8可以看出，對(duì)于干辣椒樣品，云南涮辣的辣椒堿和二氫辣椒堿的含量遠(yuǎn)高于其他辣椒品種，各種類型辣椒辣椒堿、二氫辣椒堿含量也與辣椒所屬種類一致，云南涮辣遠(yuǎn)高于其它類型，羊角辣椒含量最低。

從表7、表8可見(jiàn)，中紅河縣猛龍鄉(xiāng)哈龍村、紅河縣猛龍鄉(xiāng)(河壩地區(qū))和小米辣(江那鎮(zhèn)羊街)不同顏色辣椒的辣椒、二氫辣椒堿含量差別較大，說(shuō)明不同成熟期對(duì)于辣椒堿和二氫辣椒堿含量影響較大，可以通過(guò)采摘期不同來(lái)獲得辣椒堿類物質(zhì)含量較高的辣椒。

3 結(jié)論與討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)確定了辣椒堿和二氫辣椒堿高效液相色譜分析條件，并對(duì)色譜分析參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用色譜柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)分離，甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65%～90%，0～30min)，檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm，辣椒堿和二氫辣椒堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于1%，平均回收率都在99%以上，表明該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏，可作為辣椒堿和二氫辣椒堿含量的定量分析方法。

3.2 通過(guò)對(duì)于提取工藝的考察研究，得出了辣椒堿和二氫辣椒堿的適宜提取工藝條件:提取溶劑75%乙醇溶液;超聲溫度55℃;超聲時(shí)間50min;液固比:30∶1;提取3 次。

3.3 通過(guò)對(duì)云南省不同地區(qū)不同品種辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的研究，結(jié)果表明干辣椒中云南涮涮辣中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它類型;鮮辣椒中圓錐形辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量遠(yuǎn)低于其它類型辣椒;不同成熟期對(duì)于辣椒堿和二氫辣椒堿含量影響較大，可以通過(guò)采摘期不同來(lái)獲得辣椒堿類物質(zhì)含量較高的辣椒。

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