姜 畔，趙新淮

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

酶法交聯(lián)修飾因其反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)程度易于控制，而被廣泛地用于改善蛋白質(zhì)的功能性［1］?？纱呋澄锏鞍捉宦?lián)的酶類主要有轉(zhuǎn)移酶中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶［2］，以及氧化酶中的酪氨酸酶［3］、葡萄糖氧化酶［4］和過氧化物酶［5］。Mattinen 等［6］研究證實(shí)，酪氨酸酶可以導(dǎo)致牛血清白蛋白和β－酪蛋白的交聯(lián)。Bonet等［4］利用葡萄糖氧化酶交聯(lián)谷蛋白改善生面團(tuán)流變學(xué)特性，從而改善面包的烘焙特性。F?rgemand 等［7］對在 H2O2存在時(shí)，辣根過氧化物酶聚合乳清蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)辣根過氧化物酶可促使乳清蛋白中的β－乳球蛋白發(fā)生交聯(lián)從而導(dǎo)致蛋白聚合體生成。在H2O2存在的情況下，辣根過氧化物酶可使蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基氧化，進(jìn)而形成二酪氨酸使蛋白質(zhì)分子得以交聯(lián)［8－9］。通過辣根過氧化物酶修飾后，蛋白質(zhì)的表面疏水性、乳化性及表觀黏度等功能性質(zhì)有顯著改善［10］。利用一種氧化酶修飾食品蛋白質(zhì)的研究已有很多，但利用兩種氧化酶協(xié)同修飾食品蛋白質(zhì)的研究還很少見。為此，本研究利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O［11］2，再利用辣根過氧化物酶和H2O2對大豆分離蛋白進(jìn)行修飾;以修飾產(chǎn)物中相對二酪氨酸含量為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)確定一步法處理的適宜條件，并對反應(yīng)產(chǎn)物及產(chǎn)物酸凝膠的流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，為蛋白質(zhì)修飾技術(shù)新方法的開發(fā)提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蛋白粉 哈爾濱高科技蛋白有限公司;葡萄糖氧化酶 西格瑪奧德里奇中國有限公司;葡萄糖 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;辣根過氧化物酶上海國源生物技術(shù)有限公司;葡萄糖－δ－內(nèi)酯 鄭州陽光化工產(chǎn)品有限公司;鹽酸 天津市耀華化工廠;氫氧化鈉 北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司;硼酸 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;碳酸氫鈉、無水碳酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司。

F－4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;Gemini II高級流變儀 英國Malvern公司;HZQF160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備 大豆分離蛋白的制備參照 Zhang 等人［12］的方法。

1.2.2 一步法交聯(lián)處理適宜條件的選擇 配制蛋白質(zhì)濃度約為4%(w/v)的大豆分離蛋白母液，用0.2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0后在92℃水浴加熱10min，使蛋白質(zhì)完全變性。采用單因素實(shí)驗(yàn)，通過測定反應(yīng)后交聯(lián)產(chǎn)物的相對熒光強(qiáng)度(即相對二酪氨酸含量)，考察葡萄糖添加量、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶和反應(yīng)時(shí)間對交聯(lián)產(chǎn)物中相對二酪氨酸含量的影響。反應(yīng)體系大豆分離蛋白終濃度為3%(w/v)，葡萄糖添加量分別為0.18%、0.90%、1.8%、3.6%和7.2%，葡萄糖氧化酶添加量分別為1、2、4、6、8U/g蛋白質(zhì)，辣根過氧化物酶添加量分別為100、200、300U/g蛋白質(zhì)。反應(yīng)混合物置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)，反應(yīng)時(shí)間分別為 0.5、1、2、3、4h。反應(yīng)結(jié)束后，85℃水浴滅酶10min。待反應(yīng)液冷卻至室溫后測定其相對熒光強(qiáng)度。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5－2003);鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液配制方法－GB/T 5009.1－2003;溴甲酚綠－甲基紅混合指示劑配制方法－GB/T 5009.1－2003。

1.2.4 交聯(lián)蛋白及其酸凝膠的制備 在一步法交聯(lián)處理選擇的適宜條件下，制備一步法處理和兩步法處理的交聯(lián)蛋白樣品，在兩步法處理中，首先使用葡萄糖和葡萄糖氧化酶對大豆分離蛋白處理1h后再加入辣根過氧化物酶繼續(xù)處理2h，反應(yīng)結(jié)束后，85℃水浴滅酶10min，待樣品冷卻后凍干。

酸化凝膠的制備及其流變學(xué)測定參照Li等人的方法［13］。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%(w/v)的大豆分離蛋白和兩種交聯(lián)蛋白的分散液，調(diào)節(jié)pH至6.8，40℃下添加葡萄糖－δ－內(nèi)酯(添加量為0.15g/g蛋白質(zhì))后攪拌2min，使其充分混合，40℃下保溫2h，形成酸化凝膠(反應(yīng)后凝膠的終pH約為4.3)。

1.2.5 流變學(xué)性質(zhì)分析 分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的大豆分離蛋白和兩種交聯(lián)蛋白的分散液，調(diào)節(jié)pH至7.0，選用夾具為錐板(PP40/4°)。將樣品分散液緩慢傾注充滿夾具，溢出的多余部分用專用的塑料刮勺刮去，蓋好保溫套，在測量溫度25℃下平衡5min。

表觀黏度測定:剪切速率的范圍為0.1～100s－1，取30個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測試。

黏彈性測定:在頻率為1Hz下進(jìn)行振幅掃描，選定應(yīng)變?yōu)?.28%，以保證所測試樣品在線性黏彈區(qū)域內(nèi);然后在0.1～10Hz下進(jìn)行頻率掃描［13］。

葡萄糖－δ－內(nèi)酯酸化凝膠的流變學(xué)測試采用下述條件和方法。選用夾具為平板PP60，測試間距為1mm，上述分散液添加葡萄糖－δ－內(nèi)酯(添加量為0.15g/g蛋白質(zhì))后攪拌2min，再將樣品分散液緩慢傾注充滿夾具，溢出的多余部分用專用的塑料刮勺刮去，蓋好保溫套，于測量溫度40℃平衡5min。

時(shí)間掃描:測定參數(shù)條件為頻率1Hz，測試應(yīng)變?yōu)?%，測試時(shí)間120min。

溫度掃描:測定參數(shù)條件為加熱溫度變化40～85℃，加熱速率0.5℃/min，測試應(yīng)變?yōu)?%。

1.2.6 相對二酪氨酸含量測定 將樣品用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(pH9.5)稀釋到0.5g/L，在激發(fā)波長320nm，發(fā)射波長410nm，間隙500μm下測定相對熒光強(qiáng)度(即相對二酪氨酸含量)［14］。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0軟件中Duncan’s多重比較對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05)，利用Excel 2003軟件繪圖報(bào)告結(jié)果，其中每組實(shí)驗(yàn)或分析重復(fù)數(shù)為3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖1可見，在反應(yīng)條件為蛋白質(zhì)分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質(zhì)、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間3h時(shí)，隨著葡萄糖添加量從0增加到1.8%，交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢;當(dāng)葡萄糖添加量高于1.8%時(shí)，交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量隨著葡萄糖添加量的增加反而呈顯著降低趨勢;因此，適宜的葡萄糖添加量為1.8%。

圖1 葡萄糖添加量對交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.1 Impacts of glucose addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.2 葡萄糖氧化酶添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖2可見，在反應(yīng)條件為蛋白質(zhì)分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、葡萄糖添加量1.8%、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間3h時(shí)，當(dāng)葡萄糖氧化酶添加量小于4.0U/g蛋白質(zhì)時(shí)，隨著葡萄糖氧化酶添加量的增加，交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢;但當(dāng)葡萄糖氧化酶添加量高于4.0U/g蛋白質(zhì)時(shí)，交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量隨著葡萄糖添加量的增加而呈顯著降低趨勢。因此，適宜的葡萄糖氧化酶添加量為4.0U/g蛋白質(zhì)。

2.3 辣根過氧化物酶添加量對相對二酪氨酸含量的影響

由圖3可見，在反應(yīng)條件為蛋白質(zhì)分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間3h時(shí)，隨著辣根過氧化物酶添加量的增加，交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量呈顯著升高趨勢。在辣根過氧化物酶添加量從200U/g蛋白質(zhì)增加到300U/g蛋白質(zhì)時(shí)，添加量增加50%，而交聯(lián)蛋白的相對熒光強(qiáng)度只增加3%?？紤]辣根過氧化物酶的成本，故此，選擇辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質(zhì)。

圖2 葡萄糖氧化酶對交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.2 Impacts of glucose oxidase addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

圖3 辣根過氧化物酶對交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.3 Impacts of HRP addition on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.4 反應(yīng)時(shí)間對相對二酪氨酸含量的影響

由圖4可見，在反應(yīng)條件為蛋白質(zhì)分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4U/g蛋白質(zhì)、辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于3h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，交聯(lián)蛋白的相對熒光強(qiáng)度呈顯著升高趨勢;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于3h時(shí)，交聯(lián)蛋白的相對熒光強(qiáng)度呈降低趨勢。故此，適宜的反應(yīng)時(shí)間為3h。

綜上，在蛋白質(zhì)分散液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，一步法交聯(lián)反應(yīng)的適宜條件為葡萄糖添加量為1.8%、葡萄糖氧化酶添加量為4.0U/g蛋白質(zhì)、辣根過氧化物酶添加量為200U/g蛋白質(zhì)和反應(yīng)時(shí)間為3h;一步法和二步法處理的交聯(lián)蛋白，其相對二酪氨酸含量分別為414和381。因此，一步法處理比二步法處理更能促進(jìn)大豆分離蛋白交聯(lián)。

2.5 交聯(lián)產(chǎn)物的性質(zhì)表征

圖4 反應(yīng)時(shí)間對交聯(lián)蛋白中的相對二酪氨酸含量的影響Fig.4 Impacts of reaction time on relative dityrosine content of the cross－linked proteins

2.5.1 剪切速率對表觀黏度的影響 從圖5可以看出，原料蛋白及2個(gè)交聯(lián)蛋白的分散液皆表現(xiàn)出剪切變稀現(xiàn)象。二元酶系處理的交聯(lián)蛋白分散液的表觀黏度皆高于原料蛋白分散液，并且一步法處理的效果要高于二步法處理。Rha［15］等的研究證明:大豆分離蛋白為牛頓流體，表現(xiàn)為剪切變稀;這與本研究一致。F?rgemand［7］等證明交聯(lián)會導(dǎo)致蛋白中形成大分子物質(zhì)，使其表觀黏度升高。Hiller和Lorenzen［16］對酪蛋白的交聯(lián)研究進(jìn)一步證明交聯(lián)處理會引起表觀黏度增加。

圖5 剪切速率對交聯(lián)蛋白分散液表觀黏度的影響Fig.5 Impacts of shear rates on apparent viscosity of the dispersion of the cross－linked proteins

2.5.2 交聯(lián)處理對黏彈性的影響 從圖6中的結(jié)果可以看出，3種蛋白質(zhì)樣品分散液的黏性模量、彈性模量由大到小依次為:一步法交聯(lián)蛋白分散液、二步法交聯(lián)蛋白分散液、大豆分離蛋白分散液。

蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度與蛋白質(zhì)分子大小、溶劑與蛋白質(zhì)間的相互作用以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)［17］。Chang等的研究證明，經(jīng)二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理，酪蛋白中有大分子物質(zhì)形成，并導(dǎo)致其表觀黏度、黏性模量和彈性模量增加［18］。因此，本研究得到的交聯(lián)蛋白具有更好的流變學(xué)性質(zhì)。

2.5.3 交聯(lián)處理對酸化凝膠彈性模量影響 圖7給出了大豆分離蛋白、一步法交聯(lián)蛋白、二步法交聯(lián)蛋白在形成酸化凝膠時(shí)，時(shí)間掃描和溫度掃描結(jié)果。由此得到的成膠時(shí)間、成膠溫度分別列于表1。

表1數(shù)據(jù)顯示，二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理可以顯著降低大豆蛋白酸凝膠的膠凝溫度和膠凝時(shí)間。葡萄糖－δ－內(nèi)酯可以降低蛋白體系的pH至蛋白的等電點(diǎn)，從而使蛋白相互聚集，溶解度下降，最終形成凝膠。楊國龍［19］等的研究表明:在pH4.3時(shí)(等電點(diǎn)附近)，蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用很弱，蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間還有疏水相互作用，疏水相互作用越強(qiáng)，凝膠化溫度越低，凝膠化時(shí)間越短。而酪蛋白經(jīng)二元酶系(葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶)和葡萄糖處理后疏水性增強(qiáng)［20］。所以，二元酶系交聯(lián)處理有利于大豆蛋白分子之間形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，降低了凝膠化溫度、縮短了凝膠化時(shí)間。

圖6 交聯(lián)處理方法對交聯(lián)蛋白黏彈性的影響Fig.6 Impacts of cross－linking treatment on viseoelastieity of the dispersion of the cross－linked proteins

圖7 處理方法對酸化蛋白質(zhì)凝膠彈性模量影響Fig.7 Impacts of cross－linking treatment on elastic modulus of the acid－induced protein gels

表1 交聯(lián)處理對大豆分離蛋白成膠溫度和成膠時(shí)間的影響Table1 Impacts of cross－linking treatment on gelation temperature and gelation time of the soybean protein isolate

3 結(jié)論

3.1 采用一步法，制備交聯(lián)大豆分離蛋白的適宜條件為:葡萄糖添加量為1.8%，葡萄糖氧化酶添加量4.0U/g蛋白質(zhì)，辣根過氧化物酶添加量200U/g蛋白質(zhì)，反應(yīng)時(shí)間3h。

3.2 經(jīng)二元酶系處理后的大豆分離蛋白，其彈性模量和黏性模量提高。

3.3 與大豆分離蛋白相比，經(jīng)二元酶系一步法和二步法處理后，交聯(lián)蛋白酸凝膠的成膠時(shí)間分別縮短15.3%和20.8%，而成膠溫度分別降低14.5%和16.1%。

［1］Mannheim A，Cheryan M.Enzyme－modified proteins from corn gluten meal:preparation and functional properties［J］.Journal of American Oil Chemists’Society，1992，69(12):1163－1169.

［2］梁華民，田少君，周怡，等.轉(zhuǎn)谷氨酞胺酶對大豆分離蛋白交聯(lián)聚合作用研究［J］.糧食油脂，2004，1(2):3－6.

［3］Partanen R，Torkkeli M，Hellman M，et al.Loosening of globular structure under alkaline pH affects accessibility of βlactoglobulin to tyrosinase－induced oxidation and subsequent cross－ linking［J］.Enzyme and Microbial Technology，2011，49(2):131－138.

［4］Bonet A，Rosell C M，Caballero P A，et al.Glucose oxidase effect on dough rheology and bread quality:a study from macroscopic to molecular level［J］.Food Chemistry，2006，99(2):408－415.

［5］Heijnisa W H，Wierenga P A，Janssen A E M，et al.In－line quantification ofperoxidase－catalyzed cross－linking of(－lactalbumin in a microreactor［J］.Journal of Chemical Engineering，2010，157(2):189－193.

［6］Mattinen L M，Lantto R，Selinheimo E，et al.Oxidation of peptides and proteins by Trichoderma reesei and Agaricus bisporus tyrosinases［J］.Journel of Biotechnol，2008，133(3):395－402.

［7］F?rgemand M，Otte J，Qvis K B，et al.Cross－linking of whey proteins by enzymatic oxidation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(4):1326－1333.

［8］Stahmann M A，Spencer A K，Honold G R，et al.Cross linking of proteins in vitro by peroxidase［J］.Biopolymers，1977，16(6):1307－1318.

［9］Matheis G，Whitaker J R.Peroxidase－catalyzed cross linking of proteins［J］.Journal of Protein Chemistry，1984，3(1):35－48.

［10］Hiller B，Lorenzen P C.Properties of set－ style skim milk yoghurt as affected by an enzymatic or Maillard reaction induced milk protein oligomerisation［J］.Journal of Food Science and Technology，2011，44(4):811－819.

［11］Rasiah I A，Sutton K H，Low F L，et al.Cross－linking of wheat dough proteins by glucose oxidase and the resulting effects on bread and croissants［J］.Food Chemistry，2005，89(4):325－332.

［12］Zhang Y N，Liu N，Zhao X H.A study on the preparation and some functional properties of a cross－linked casein－gelatin composite by a microbial transglutaminase［J］.International Journal of Food Science and Technology，2011，46(12):2641－2647.

［13］Li F，Kong X Z，Zhang C M，et al.Gelation behaviour and rheological properties of acid－induced soy protein－stabilized emulsion gels［J］.Food Hydrocolloids，2012，29(2):347－355.

［14］Davies K J，Delsignore M E，Lin S W，et al.Protein damage and degradation by oxygen radicals.II.modification of amino acids［J］.Journal of Biological Chemistry，1987，262(20):9902－9907.

［15］Rha C K.Rheology of fluid foods［J］.Food Technology，1978，32(7):77－82.

［16］Hiller B，Lorenzen P C.Functional properties of milk proteins as affected by enzymatic oligomerisation［J］.Food Research International，2009，42(8):899－908.

［17］Jiang S J，Zhao X H.Transglutaminase－ induced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product［J］.International Dairy Journal，2011，21(4):198－205.

［18］Damodaran S.Amino acids，peptides，and proteins［M］.In Food Chemistry(3rd edition);Fenema O R;Eds.;Marcel Dekker，Inc.:New York，USA，1996，321－429.

［19］楊國龍，趙謀明，楊曉泉，等.改性大豆蛋白的凝膠流變性［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2007，22(6):43－46.

［20］Chang C H，Zhao X H.In vitro digestibility and rheological properties of the caseinates treated by an oxidative system containing horseradish peroxidase，glucose oxidase and glucose［J］.International Dairy Journal，2012，27(1－2):47－52.