劉海濤,張?jiān)撇?吳文華,趙雅坤

(1.中國石油大學(xué)(華東)環(huán)境與安全工程系,山東青島266580;2.昌樂縣環(huán)保局,山東濰坊262499)

高效耐高溫石油降解菌降解石油的促進(jìn)因子研究

劉海濤1,張?jiān)撇?,吳文華2,趙雅坤1

(1.中國石油大學(xué)(華東)環(huán)境與安全工程系,山東青島266580;2.昌樂縣環(huán)保局,山東濰坊262499)

將耐高溫石油降解菌UM6-3菌懸液接種于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振蕩培養(yǎng)6 d。分別考察環(huán)境因子中的初始p H值、石油含量、振蕩器轉(zhuǎn)速,營養(yǎng)平衡因子中的氮源、氮磷比,生物因子中的接種量、酵母粉添加量對石油降解的促進(jìn)作用?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)初始p H值、接種量、氮磷比、石油含量、振蕩器轉(zhuǎn)速的5因素4水平正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,影響石油降解的主要因子是振蕩器轉(zhuǎn)速和接種量,初始p H值的影響最小;UM6-3降解石油的最佳促進(jìn)因子為:初始p H值7,接種量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振蕩器轉(zhuǎn)速140 r·min-1。

石油降解;耐高溫;促進(jìn)因子;營養(yǎng)平衡

隨著新疆成為我國油氣資源戰(zhàn)略接替區(qū),大漠荒灘的石油開發(fā)如火如荼,隨之帶來的石油污染問題日益嚴(yán)重。新疆地區(qū)夏季高溫干旱,迫切需要高效的耐高溫石油降解菌進(jìn)行生物修復(fù)。作者分別研究了環(huán)境因子、營養(yǎng)平衡因子、生物因子對高效耐高溫石油降解菌UM6-3降解石油的促進(jìn)作用,并確定了UM6-3降解石油的最佳促進(jìn)因子,擬為高溫干旱環(huán)境的生物修復(fù)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

石油:采自新疆百口泉井區(qū),密度0.792 g· cm-3,粘度1923.14 mPa·s(50℃),飽和烴含量71.17%,芳香分含量18.42%,膠質(zhì)含量9.89%,瀝青質(zhì)含量0.52%。

OIL-510型全自動紅外分光測油儀,北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司;ZQ-HA型水浴振蕩器,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種:通過紫外-微波復(fù)合誘變得到3株耐高溫石油降解菌,分別為紅球菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬,復(fù)配得到高效耐高溫石油降解混合菌UM6-3,其最適生長溫度為47.5℃,能夠耐受65℃高溫,最適培養(yǎng)時間為6 d。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM):Na2HPO40.6 g, KH2PO40.2 g,Na NO34.0 g,MgSO40.3 g,CaCl20.01 g,FeSO40.01 g,酵母粉0.5 g,蒸餾水1000 m L,p H值7.0。

1.3 方法

將UM6-3菌懸液接種于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振蕩培養(yǎng)6 d,分別考察環(huán)境因子中的初始p H值、石油含量、振蕩器轉(zhuǎn)速,營養(yǎng)平衡因子中的氮源、氮磷比(N∶P,質(zhì)量比,下同),生物因子中的酵母粉添加量、接種量對石油降解的促進(jìn)作用。

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以初始p H值、接種量、氮磷比、石油含量、振蕩器轉(zhuǎn)速為考察因素,以石油降解率為考核指標(biāo),進(jìn)行5因素4水平正交實(shí)驗(yàn),以期獲得UM6-3降解石油的最佳促進(jìn)因子。正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

1.4 石油降解率的測定

初始石油含量依據(jù)培養(yǎng)基添加石油前后的質(zhì)量計(jì)算獲得。

培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的石油含量,依據(jù)GB/T 16488 -1996《水質(zhì)、石油類和動植物油的測定 紅外光度法》用全自動紅外分光測油儀測定,并稍作改進(jìn):培養(yǎng)基中的石油經(jīng)UM6-3降解后變?yōu)槲⑿⌒躞w,萃取液通過鋪有無水Na2SO4的砂芯漏斗脫水時極易堵塞,因此用循環(huán)水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中,為了保證脫水效果,將無水Na2SO4的厚度增加至15 mm[1]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境因子對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用

2.1.1 初始p H值

微生物的生命活動、物質(zhì)代謝與p H值有密切的關(guān)系[2,3]。p H值對微生物生命活動的影響主要有:一是引起細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)、核酸電荷的變化從而導(dǎo)致細(xì)胞活性變化;二是p H值過高會對降解菌的生長和降解酶的分泌及其活性產(chǎn)生不利影響,而p H值過低時,氫離子濃度超過微生物酶的適應(yīng)范圍,又使微生物原生質(zhì)膜的電荷發(fā)生變化,從而改變微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力;三是改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性和毒性物質(zhì)的毒性。一般認(rèn)為,低p H值會影響氮的轉(zhuǎn)化,當(dāng)p H值稍高于中性時,對硝化作用和氮的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化有利,且磷的有效性在p H值6～8時最高。

初始p H值對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖1。

圖1 初始p H值對石油降解的促進(jìn)作用Fig.1 The promotion effect of initial p H value on petroleum degradation

由圖1可知,偏堿性環(huán)境對UM6-3的石油降解效果有明顯的促進(jìn)作用。在初始p H值為5～11的范圍內(nèi),隨著初始p H值的增大,UM6-3的石油降解率先上升后下降,在初始p H值為8時最高,為62.49%。表明UM6-3具有很強(qiáng)的酸堿耐受性,在初始p H值6～10的環(huán)境中,石油降解率均超過50%。

2.1.2 振蕩器轉(zhuǎn)速

振蕩器轉(zhuǎn)速主要是影響培養(yǎng)過程的溶解氧含量[4,5]。微生物降解石油烴的途徑雖然不同,但是在降解過程中都需要大量的電子受體。氧是微生物好氧呼吸的最終電子受體,在生物降解過程中有兩個作用: (1)參與生物修復(fù)過程中部分物質(zhì)合成,利用氧化過程抵抗產(chǎn)生的有毒物質(zhì);(2)參與甾醇類和不飽和脂肪酸的合成。據(jù)計(jì)算,降解1 g石油需要0.3～0.4 g氧氣。因此,提高振蕩器轉(zhuǎn)速可以增加溶解氧含量,還可以增加微生物細(xì)胞與石油烴的接觸機(jī)會,從而促進(jìn)微生物降解石油,但過高轉(zhuǎn)速造成的剪切作用會對細(xì)胞造成損傷,反而會抑制石油的降解。振蕩器轉(zhuǎn)速對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖2。

圖2 振蕩器轉(zhuǎn)速對石油降解的促進(jìn)作用Fig.2 The promotion effect of rotation speed on petroleum degradation

由圖2可知,UM6-3的石油降解率隨振蕩器轉(zhuǎn)速的增大先上升后下降,在振蕩器轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時最高,為65.58%。

2.1.3 石油含量

石油含量是影響微生物降解的主要因素之一。石油含量太低對降解菌的存活、維持降解所必需的降解菌的數(shù)量以及誘導(dǎo)微生物降解酶的產(chǎn)生都是不利的;但石油含量過高時又會影響細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換,并對微生物產(chǎn)生毒性,還會在培養(yǎng)基表面形成油膜,影響氧氣向培養(yǎng)基中擴(kuò)散,導(dǎo)致微生物的生長繁殖因缺氧而受到抑制。只有當(dāng)石油含量適宜時才能誘導(dǎo)微生物降解酶的產(chǎn)生,達(dá)到好的降解效果[6]。石油含量對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖3。

由圖3可知,隨著石油含量的增加,UM6-3的石油降解率先逐漸上升后顯著下降,在石油含量為3%時最高,為67.29%。

圖3 石油含量對石油降解的促進(jìn)作用Fig.3 The promotion effect of petroleum content on petroleum degradation

2.2 營養(yǎng)因子對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用

研究表明營養(yǎng)元素是影響微生物降解石油污染物的關(guān)鍵因素[7]。只有環(huán)境中的營養(yǎng)元素滿足微生物生長代謝的需要時,微生物才能充分發(fā)揮降解石油的能力,從而提高石油污染物的降解效果。

2.2.1 氮源

氮是微生物生長必需的營養(yǎng)元素[8],也是影響石油降解菌降解效率的重要營養(yǎng)物質(zhì)。氮源對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖4。

圖4 氮源對石油降解的促進(jìn)作用Fig.4 The promotion effect of nitrogen source on petroleum degradation

由圖4可知,總體來說,無機(jī)氮源優(yōu)于有機(jī)氮源,銨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮,酰胺態(tài)氮最次。其中NH4Cl作為氮源時,UM6-3的石油降解率最高,達(dá)到68.47%,明顯高于Na NO3作為氮源的61.25%,促進(jìn)作用明顯。這是因?yàn)?有機(jī)氮源同時作為碳源,將優(yōu)先于石油組分被UM6-3利用,從而妨礙了石油降解效果,同時銨態(tài)氮水解具有緩沖作用,利于保持培養(yǎng)基p H值的穩(wěn)定。

2.2.2 氮磷比

碳和氮是構(gòu)成菌體成分的重要元素,它們與主要的無機(jī)營養(yǎng)元素磷之間需滿足一定比例,若比例失調(diào),就會影響微生物的正常生長繁殖,使微生物的生物活性及各種性能受到影響[9],因此氮磷比是石油降解中重要的控制條件之一。氮磷比對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖5。

圖5 氮磷比對石油降解的促進(jìn)作用Fig.5 The promotion effect of nitrogen-phosphorus ratio on petroleum degradation

由圖5可知,隨著氮磷比的增大,UM6-3的石油降解率先顯著上升后逐漸下降,在氮磷比為5∶1時最高,為67.01%。

2.3 生物因子對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用

2.3.1 接種量

微生物的種類和數(shù)量[10]對石油降解的影響較大。接種量太少,細(xì)菌生長的延遲期較長,石油降解的啟動時間延后,不利于石油降解;而接種量太多,又會引起營養(yǎng)物質(zhì)的競爭,導(dǎo)致單個菌體得不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì),同樣不利于石油降解。接種量對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖6。

圖6 接種量對石油降解的促進(jìn)作用?Fig.6 The promotion effect of inoculum amount on petroleum degradation

由圖6可知,隨著接種量的加大,UM6-3的石油降解率先顯著上升后有所下降,在接種量為4 m L時最高,為67.36%。

2.3.2 酵母粉添加量

大量研究證明酵母粉在生物降解中發(fā)揮著積極的作用,能提供微生物生長所需的堿基、嘌呤、嘧啶等生長因子和微量營養(yǎng)元素[11,12],但酵母粉添加量過多時,其中所含的有機(jī)物又會妨礙微生物對石油的利用。酵母粉添加量對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用見圖7。

圖7 酵母粉添加量對石油降解的促進(jìn)作用Fig.7 The promotion effect of yeast powder addition amount on petroleum degradation

由圖7可知,培養(yǎng)基中加入酵母粉后,UM6-3的石油降解率先迅速上升后逐漸下降,在酵母粉添加量為1 g·L-1時最高,為65.34%。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知,各因素對UM6-3降解石油效果的影響大小依次為:振蕩器轉(zhuǎn)速＞接種量＞石油含量＞氮磷比＞初始p H值,主要影響因子是振蕩器轉(zhuǎn)速和接種量,初始p H值的影響最小。確定了最佳組合為: A1B3C2D1E3,即最佳促進(jìn)因子為:初始p H值7,接種量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振蕩器轉(zhuǎn)速140 r·min-1。

3 結(jié)論

將耐高溫石油降解菌UM6-3菌懸液接種于100 m L石油MSM中,在47.5℃下振蕩培養(yǎng)6 d。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了環(huán)境因子中的初始p H值、振蕩器轉(zhuǎn)速、石油含量,營養(yǎng)平衡因子中的氮源、氮磷比以及生物因子中的接種量、酵母粉添加量對UM6-3降解石油的促進(jìn)作用。正交實(shí)驗(yàn)表明,影響石油降解的主要因子是振蕩器轉(zhuǎn)速和接種量,初始p H值的影響最小;確定UM6-3降解石油的最佳促進(jìn)因子為:初始p H值7,接種量4 m L,氮磷比5∶1,石油含量1%,振蕩器轉(zhuǎn)速140 r·min-1。

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Study on the Promotion Factors for Degradation of Petroleum by High Efficient Thermostable Petroleum Degrading Bacteria

LIU Hai-tao1,ZHANG Yun-bo1,WU Wen-hua2,ZHAO Ya-kun1
(1.Department of Environmental and Safety Engineering,China University of Petroleum, Qingdao 266580,China;2.Changle Enviromental Protection Bureau,Weifang 262499,China)

UM6-3 Bacteria were seeded in the 100 m L of petroleum MSM,and cultured for 6 d with shaking under the temperature of 47.5℃.The environmental factors(such as initial p H value,petroleum content,rotation speed),nutritional balance factors(such as nitrogen source,nitrogen-phosphorus ratio)and biological factors(inoculum amount and yeast powder addition amount),which may promote the effect of petroleum degradation,were studied.Based on the single factor experiment results,the L16(54)orthogonal experiment was designed for the factors including initial p H value,inoculum amount,petroleum content,nitrogen-phosphorus ratio and rotation speed.The results showed the main factors affecting the petroleum degradation were rotation speed and inoculum amount,initial p H value was inferior.For UM6-3,the optimum promoting factors were as follows:initial p H value of 7,inoculum amount of 4 m L,N∶P of 5∶1,petroleum content of 1%,rotation speed of 140 r·min-1.

petroleum degradation;thermostable;promotion factor;nutritional balance

Q 939.97

A

1672-5425(2013)03-0039-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.010

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(11CX06048A)

2012-12-26

劉海濤(1987-),男,河南洛陽人,碩士研究生,研究方向:生物技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用;通訊作者:張?jiān)撇?副研究員, E-mail:zyb0065@163.com。