林麗娜，談 燕，朱定衡，趙 瑾，陳江漢

在中國大陸引起人類疾病的隱球菌主要是新生隱球菌，它有2 個血清型，5 個基因型。在自然界中絕大部分新生隱球菌存在于鴿糞中，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此鳥糞和人體中的隱球菌之間的關系一直為人們所關注。對此，國外已有關于這方面的研究[1,2]，國內(nèi)的研究大都集中于臨床株。本研究擬對中國大陸新生隱球菌環(huán)境株的基因型和分子特征進行初步分析，以期進一步了解環(huán)境株與臨床株之間的內(nèi)在關系。

1 材料與方法

1.1 標本

所有標本采集于2011 年2 月～2012 年2 月黑龍江省、北京市、上海市、江蘇省、浙江省、四川省、廣西壯族自治區(qū)等地區(qū)私人和公共養(yǎng)鴿場所(如人寓所、公棚及廣場等)，不限季節(jié)，共計1 372 份。主要利用各地信鴿協(xié)會集鴿時采集鴿糞，以痰瓶封閉保存并標記，送至實驗室分批分離；鴿糞外觀以不干不濕為佳，每次每份約采集2 g。

1.2 方法

1.2.1 鴿糞中新生隱球菌的分離 培養(yǎng)基采用咖啡酸玉米瓊脂培養(yǎng)基(caffeic acid cornmeal agar，CACA)，試驗證實此方法可以較好地分離出新生隱球菌環(huán)境株[3]。其制備方法如下：取40 g 玉米粉加入到1 L 蒸餾水中，80 ℃水浴20 min 后用尼龍布過濾，補充蒸餾水至1 L 后加入300 mg 咖啡酸，125 mg 氯霉素和20 g 瓊脂。100 kPa 高壓滅菌15 min 后制成CACA 平板（直徑100 mm）。將采集的標本分置于無菌瓶中，取1.0 g 加入10 ml 無菌生理鹽水，充分震蕩混勻，溶解后靜止15 min，使之沉淀。吸取0.5 ml 上清液接種于CACA 培養(yǎng)基上，30 ℃孵育2 周，每3 d 觀察1 次。若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上有棕褐色菌落生長，即將其挑取接種于YEPD 培養(yǎng)基（1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）上進行分離純化。印度墨汁涂片染色，在顯微鏡下見厚壁、圓形帶有清晰莢膜的孢子，即可初步確定為隱球菌。

1.2.2 尿素酶試驗 尿素瓊脂培養(yǎng)基的配制：①將蛋白胨 1 g，葡萄糖 1 g，NaCl 5 g，KH2PO42 g，尿素 20 g 加入到100 ml 蒸餾水中，徹底混合溶解，再加入酚紅 0.012 g，在室溫25 ℃下調(diào)整pH 6.0±0.1。②將上述配制好的溶液過濾消毒。③溶解15 g 瓊脂到900 ml 蒸餾水中煮沸及高壓滅菌消毒（121 ℃，15 min）。④等待冷卻至50℃～55 ℃，無菌操作加入②中液體。⑤徹底混合后分裝于平皿以備用。以標準菌株新生隱球菌H99 作為陽性對照，白念珠菌ATCC76615∶09 作為陰性對照，將分離純化后的待檢菌接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)1 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化，培養(yǎng)基呈粉紅或桃紅色為陽性，說明該菌能產(chǎn)生尿素酶，否則為陰性。

1.2.3 37 ℃生長試驗 以標準菌株新生隱球菌H99作為陽性對照，白念珠菌ATCC76615∶09 作為陰性對照，將分離純化后的待檢菌接種于YEPD 培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長情況。培養(yǎng)基見菌落生長，則為陽性，否則為陰性。

1.2.4 M13-PCR 將上述環(huán)境菌株進行PCR 指紋分析，結合核糖體基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)( internal transcribedspacer, ITS)序列及系統(tǒng)進化分析。圖1 中的3 株菌[Hljf4（黑龍江）、Sh2（上海）、SC6（四川）]分別代表中國大陸不同地區(qū)的環(huán)境株，并與有地域代表性的臨床株JMY（遼寧）、YGY（浙江）、WSS（江蘇）和5 株標準株VN Ⅰ(WM148) 、VN Ⅱ(WM626)、VN Ⅲ(WM628) 、VN Ⅳ(WM629) 、VNB (BT63)作對照。①隱球菌基因組DNA 的抽提按照Wang 等[5]氯化芐法操作。②M13-PCR 指紋分型按照Meyer 等[6]反應體系及反應條件操作。③ITS 基因擴增及測序按照Katsu 等[7]凝膠電泳檢查分析系統(tǒng)比較臨床菌株與標準株擴增條帶的異同，不比較相應條帶亮度的強弱，僅比較條帶的有無，進行分型歸類。

圖1 部分新生隱球菌環(huán)境株及臨床株、標準株M13-PCR指紋圖譜凝膠電泳圖

1.2.5 動物毒力試驗 以10 只9 周大的BALB/c 雌性小鼠，選取環(huán)境株Hljf4、Sh2、SC6，臨床株JMY、YGY、WSS，標準株H99、VN Ⅰ(WM148)、VN Ⅱ(WM626)，由尾靜脈注射1×108菌數(shù)/株[4]，共觀察2 個月，1 周1 次，觀察動物的存活率。

2 結果

2.1 新生隱球菌分離結果

集鴿鴿糞分離新生隱球菌結果見表1，從分離結果可見集鴿鴿糞分離率大于公共廣場。

表1 不同地域集鴿鴿糞分離新生隱球菌菌株比較（株）

2.2 尿素酶試驗

所有受試菌與陽性對照菌在尿素培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 min ～1 d，培養(yǎng)平皿均出現(xiàn)桃紅色色素，陰性對照管始終未見變色，未發(fā)現(xiàn)尿素酶陰性菌株。

2.3 37 ℃生長試驗

所有受試菌與陽性對照菌在YEPD 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后均出現(xiàn)菌落生長，陰性對照組未見生長，未發(fā)現(xiàn)37 ℃生長陰性菌株。

2.4 M13-PCR

環(huán)境株與3 株臨床株以及標準株的M13-PCR 指紋圖譜顯示，它們均為VNⅠc 基因型，顯示了與臨床株的高度一致性。ITS 序列分析表明，它們均屬于血清型A 。標準株及臨床株、環(huán)境株M13-PCR 指紋圖譜見圖1。ITS 序列分析結果已上傳至美國國家生物技術信息中心（NCBI）Genebank（JMY NCBI Genbank 序列號：GQ850150）。

2.5 動物毒力試驗

動物毒力試驗見圖2。3 株感染新生隱球菌環(huán)境株Hljf4、Sh2、SC6 的小鼠分別與感染新生隱球菌臨床株JMY、YGY、WSS 的小鼠出現(xiàn)相近的存活率，并與感染VNⅠ、VNⅡ的存活率相近，且均未死亡，而感染H99 的小鼠在第20 d 死亡。提示新生隱球菌環(huán)境株及臨床株的毒力相近，且毒力均小于H99。

圖2 動物毒力試驗

3 討論

研究新生隱球菌環(huán)境株與臨床株關系的意義在于揭示其感染人體的自然過程，為臨床上有效預防和治療該病提供可能的方法和途徑。中國大陸的臨床株為獨特的VNⅠc 型，且表現(xiàn)出明顯的一致性[8]，并與周邊國家如韓國、越南等相似。這些均提示它們可能有共同的來源，但未得到證實。M13-PCR 顯示，中國大陸不同區(qū)域的新生隱球菌環(huán)境株也都是VNⅠc 型，且一致性明顯。因此證實，我國大陸地區(qū)的臨床株可能均來自于自然界中的鴿糞。由于新生隱球菌較易發(fā)生于免疫缺陷患者，因此對這些易感人群的防控將會大大降低疾病的發(fā)生率。

本次調(diào)查顯示鴿糞中新生隱球菌的陽性分離率平均約為5.5%，低于國內(nèi)外文獻報道[9-14]，這可能與采集方法、標本新鮮程度、陽光、溫度、氣候和分離方法等有關。

調(diào)查結果顯示，來源于集鴿鴿糞的分離率高于公共廣場，可能的原因是，利用各地集鴿時間采集的鴿糞基本來自每戶私人養(yǎng)鴿場所，其通風不良，鴿棚地面和籠子中堆積的鴿糞也較厚，這些條件可能為新生隱球菌在鴿糞中生長繁殖提供了更為適宜的條件。另外，分離率還與地域相關，按照北緯20oN ～50oN劃分的3 個區(qū)域，鴿群的標本分離率以20oN ～30oN最高(G3，15.25%)，其次為40oN ～50oN (G1，5.45%)，30oN ～40oN (G2，5.1%)最低。分析其原因，可能除了與飼養(yǎng)條件、鴿子的活動習性、運動遷徙等有關外，還與氣候條件緊密相關，提示相應的自然環(huán)境(溫帶)更適合該真菌的生存。這些原因與致病力及環(huán)境pH值的關系有待進一步研究。

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