蔣繼志，黃杰，吳真真，劉海珍

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病是全球馬鈴薯生產(chǎn)中最具毀滅性的病害，其造成的經(jīng)濟損失、防治難度以及對全社會的影響已超過了水稻稻瘟病和小麥銹病，被視為國際第一大作物病害［1］.生產(chǎn)中除利用有限的抗病品種和適宜于局部地區(qū)的農(nóng)業(yè)栽培措施外，化學農(nóng)藥仍是主要的防治措施.但隨著病菌A2交配型相繼在世界各地出現(xiàn)，病菌生理分化和遺傳變異更加迅速且復雜，由此導致的品種抗病性喪失、病菌抗藥性、農(nóng)藥殘留以及環(huán)境污染等一系列問題日益突出，更加大了馬鈴薯晚疫病的防治難度［2］.利用拮抗真菌［3］、細菌［4］、放線菌［5］及其代謝產(chǎn)物抑制致病疫霉，控制馬鈴薯晚疫病已成為當前重要的研究方向之一.本課題組在前期已探明梨黑斑病菌（Alternaria alternata）LH－03菌株及其發(fā)酵液對致病疫霉均有顯著的抑制作用，抑制率分別為58%和70.2%，與白菜黑斑病菌發(fā)酵液混合后的抑菌率可達90.38%［6］，優(yōu)化發(fā)酵條件后其發(fā)酵液的抑菌率可達85%［7］.本實驗旨在明確該菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的基本性質(zhì)以及防病效果，為抗菌物質(zhì)的分離提純、結(jié)構(gòu)分析鑒定和實際利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌種

梨 黑 斑 病 菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）LH－03 及 致 病 疫 霉（Phytophthora infestans（Mont.）de Bray）Z108，為本實驗室保存菌種.

1.2 發(fā)酵液的最適抑菌質(zhì)量濃度確定

依據(jù)劉海珍等［7］優(yōu)化的發(fā)酵條件制備LH－03菌株發(fā)酵液，經(jīng)細菌過濾器（0.22μm）除菌后，凍干或用無菌去離子水稀釋，配制成質(zhì)量濃度（ρ）分別為47.7（濃縮10倍），23.85（濃縮5倍），4.77（原液），0.48（稀釋10倍），0.10（稀釋50倍），0.05mg／mL（稀釋100倍）的溶液，以等體積液體培養(yǎng)基作對照，采用濾紙片法測定抑菌活性，統(tǒng)計抑菌率［6］.

1.3 發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的初步分析

LH－03菌株發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的分析主要包括：1）先用乙醇再用硫酸銨沉淀［8］，用2倍體積95%（體積分數(shù)）乙醇沉淀，離心后的上清液經(jīng)50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得A 組分，沉淀用無菌去離子水溶解后得B組分，A 組分再經(jīng)559g／L硫酸銨沉淀，離心后上清液經(jīng)透析得到C 組分，沉淀為D 組分，以細菌過濾器除菌后用濾紙片法［6］分別測定A，B，C和D 各組分的抑菌活性，以等體積95%（體積分數(shù)）乙醇和559g／L 硫酸銨為對照；2）先確定硫酸銨質(zhì)量濃度再用乙醇沉淀［8］，以194，258，326，398，476，559g／L的硫酸銨分級沉淀，得到最適硫酸銨質(zhì)量濃度所沉淀的E組分；E組分再經(jīng)2倍體積95%乙醇（體積分數(shù)）沉淀，離心后的上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得F組分，沉淀用無菌去離子水溶解后得G 組分，過濾除菌后分別測定E，F(xiàn) 和G各組分的抑菌活性［6］；3）用蛋白酶K 和酚－氯仿－異戎醇處理對致病疫霉有顯著抑制活性的粗蛋白提取物［8］，1 350mL粗蛋白提取物中加入0.2mg／mL蛋白酶K 液150μL，37 ℃下反應5h，或加入等體積的酚－氯仿－異戊醇（三者的體積比為25:24:1）溶液，充分混勻后經(jīng)4 ℃、10 000r／min離心20min，上清液經(jīng)細菌過濾器除菌后，以酚－氯仿－異戊醇溶液作對照測定抑菌活性［6］；4）硫酸銨沉淀所得的蛋白質(zhì)類物質(zhì)按照文獻［8］的方法制備蛋白樣品、電泳緩沖液、分離膠和濃縮膠等進行SDS－PAGE電泳.

1.4 粗蛋白的最適抑菌質(zhì)量濃度及在馬鈴薯塊莖切片上的防病作用

最適質(zhì)量濃度硫酸銨所沉淀的粗蛋白質(zhì)量濃度的測定采用考馬斯亮藍G－250比色法［9］，得到的粗蛋白提取物用無菌去離子水定容、細菌過濾器除菌后，再以無菌去離子水分別稀釋0 倍（3.50 mg／mL）、2 倍（1.75mg／mL）、5倍（0.70mg／mL）、8倍（0.44mg／mL）、10倍（0.35mg／mL）和20倍（0.18mg／mL），濾紙片法測定其抑菌活性［6］，并按照文獻［8］的方法測試粗蛋白溶液在馬鈴薯塊莖切片上對致病疫霉的預防效果.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液的最適抑菌質(zhì)量濃度

LH－03菌株不同質(zhì)量濃度的發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長均有明顯的抑制作用，由圖1可看出，隨發(fā)酵液質(zhì)量濃度增加，抑菌作用逐漸增強；發(fā)酵液稀釋100倍（0.05mg／mL）后其抑菌作用最弱，但抑菌率也達到了73%左右，濃縮10倍（47.7mg／mL）后的抑菌作用最強，抑菌率可高達96%左右.

2.2 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的分析

發(fā)酵液原液經(jīng)乙醇沉淀后得到的A 組分（上清液）與B組分（沉淀）的抑菌率分別為72.5%和33.3%，A組分再經(jīng)硫酸銨沉淀后得到的C組分（上清液）和D 組分（沉淀）的抑菌率分別為9.3%和66.7%.表明發(fā)酵液中的主要抑菌成分不能被乙醇沉淀，但能被硫酸銨沉淀.進一步用硫酸銨分級沉淀的方法沉淀發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)，結(jié)果如圖2所示，隨硫酸銨質(zhì)量濃度增加，所得物質(zhì)對致病疫霉的抑制作用增強，其中以559g／L的硫酸銨沉淀下來的E組分對致病疫霉的抑菌作用最強，抑菌率達到了83%，這說明硫酸銨質(zhì)量濃度越高，能沉淀下來的抑菌物質(zhì)可能越多，因此抑菌率也就越高；硫酸銨沉淀E 組分后，上清液再經(jīng)乙醇沉淀后得到的F組分（上清液）和G 組分（沉淀）對致病疫霉均無抑制作用，表明發(fā)酵液中對致病疫霉發(fā)揮抑制作用的主要抑菌物質(zhì)可能是蛋白類物質(zhì).將經(jīng)過559g／L硫酸銨沉淀獲得的粗蛋白用蛋白酶K 和變性劑酚－氯仿－異戎醇分別處理后，前者對致病疫霉的抑菌率為62.6%，后者無抑菌作用，表明該粗蛋白對蛋白酶K 具有一定的耐受性，但對變性劑（酚－氯仿－異戎醇）敏感；進一步用酚－氯仿－異戎醇處理發(fā)酵液原液后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液原液也喪失了抑菌活性，由此證明LH－3發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì).

圖1 不同質(zhì)量濃度發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的影響Fig.1 Effect of fermentation liquid mass concentrations on mycelial growth of Phytophthora infestans

圖2 不同質(zhì)量濃度硫酸銨溶液中粗蛋白對致病疫霉菌絲生長的影響Fig.2 Effect of sulphate ammonium mass concentrations on growth of Phytophthora infestans

2.3 粗蛋白的電泳分析

LH－03菌株發(fā)酵液中經(jīng)不同質(zhì)量濃度的硫酸銨沉淀得到的粗蛋白，在質(zhì)量濃度60g／L 的濃縮膠和120g／L的分離膠條件下，SDS－PAGE電泳的效果較好（圖3）.其中194和258g／L 硫酸銨處理下未見蛋白條帶出現(xiàn)，可能是沉淀的蛋白含量比較少；而326～559mg／L的硫酸銨處理下均清晰地顯示出1條帶，其分子質(zhì)量大小約為40ku.

2.4 粗蛋白的最適抑菌質(zhì)量濃度

考馬斯亮藍G－250比色法測得100mL 發(fā)酵液中經(jīng)559g／L 硫酸銨沉淀所得粗蛋白的質(zhì)量濃度約為17.5mg／mL，用不同質(zhì)量濃度的粗蛋白抑制致病疫霉后，發(fā)現(xiàn)隨粗蛋白質(zhì)量濃度降低，抑制作用逐漸減弱，粗蛋白質(zhì)量濃度為3.5mg／mL時的抑制率最高（68%），但稀釋20倍后其抑菌活性幾乎完全喪失（圖4）.以質(zhì)量濃度為3.5mg／mL的粗蛋白溶液處理馬鈴薯塊莖切片后（圖5），發(fā)現(xiàn)粗蛋白溶液對塊莖切片無不良影響（圖5a），對致病疫霉侵染塊莖切片有良好的保護作用（圖5b），保護率達95%以上.

圖3 粗蛋白的SDS－PAGE電泳分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of crude proteins

圖4 不同濃度粗蛋白對致病疫霉菌絲生長的抑制作用Fig.4 Inhibition of crude proteins at different concentrations on Phytophthora infestans

3 討論

利用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物抑制致病疫霉進而控制馬鈴薯晚疫病已展示出較大的應用潛力［1］，篩選獲得的一些拮抗真菌，在平板上能完全抑制致病疫霉菌絲的生長，抑菌率達到100%，在離體組織、盆栽植株和溫室中的防病效果能分別達到95%，90%和80%［10］，但迄今作為生防制劑實際用于田間防治馬鈴薯晚疫病的拮抗真菌還不多見，主要是這些菌株或其代謝產(chǎn)物在大田中的防病效果常常急劇下降甚至完全喪失，致使這些菌株無法利用，筆者認為主要原因是對拮抗菌株所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的研究還十分有限.Son等［11］研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）EF119菌株主要是通過比卡菌素（bikaverin）和鐮刀菌酸（fusaric acid）抑制致病疫霉，對番茄晚疫病的防效分別為71%和67%，且明顯抑制其他植物病原卵菌、真菌和細菌的生長；蘇珍珠等［10］的研究表明，幾株內(nèi)生鐮刀菌是依靠毒素抑制致病疫霉，其中有3株菌（e012－3，e060－4和e032）毒素粗提液的抑菌率均達到100%，對馬鈴薯葉片的保護率達到97.1%；Eschen－Lippold等［12］的研究結(jié)果顯示，象牙白蠟傘（Hygrophorus eburneus）是以γ－Oxocrotonate脂肪酸抑制致病疫霉等多種病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，提前噴霧可有效防治馬鈴薯晚疫?。粍允|等［13］探討了黑附球菌（Epicoccum nigrum）拮抗致病疫霉的活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的蛋白和多糖無明顯抑菌作用，但粗脂肪有一定的抑制作用，對孢子囊萌發(fā)的抑制中質(zhì)量濃度為1 301.1μg／mL，同時發(fā)現(xiàn)去除多糖后的胞外物質(zhì)有較強的抑制作用，對孢子囊和菌絲生長的抑制中質(zhì)量濃度（EC50）分別為576.3μg／mL 和850.1μg／mL；本實驗中拮抗真菌LH－03菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其分子質(zhì)量大小約為40ku，與上述對致病疫霉拮抗真菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)的報道均不相同，說明致病疫霉拮抗真菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)多種多樣.尤其是本研究中的LH－03菌株產(chǎn)生的粗蛋白對致病疫霉菌絲生長的抑菌率雖然不是很高（72%），但在馬鈴薯塊莖切片上對致病疫霉侵染的保護率可達95%以上，表明該抗菌物質(zhì)具有雙重作用，不僅明顯抑制致病疫霉生長，還有可能誘導馬鈴薯塊莖對晚疫病的抗性.因此，利用該粗蛋白防治馬鈴薯晚疫病有很大潛力，對該蛋白質(zhì)的分離純化有待盡快開展，以加快對該蛋白質(zhì)防病效果、作用機理、實際利用等方面的進程.

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