肖功年，李言郡，陳 波，林玲玲，尤玉如

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，杭州310023；3.杭州娃哈哈集團有限公司，杭州310018）

圖1 花色苷結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of anthocyanidin

紫葡萄皮中含有大量糖苷，為花色苷配基花青素（anthocyanidin）［1－2］，是苯丙吡喃（phenotyrilium）的衍生物，有黃酮的C6C3C6結(jié)構(gòu)（圖1）［3］，具有陽離子的性質(zhì)。葡萄中的花色苷主要為矢車菊素、飛燕草素、錦葵色素、甲基花青素及矮牽牛苷配基（petunidin）5種花色素誘導(dǎo)體［4－5］。據(jù)報道，花色苷具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗氧化、抗腫瘤、延緩血小板凝集等營養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力［6］。但花色苷通常不太穩(wěn)定，在葡萄中主要以糖苷形式（即花色苷）存在。紫葡萄皮中糖苷提取較難，而超聲波提取不改變有效成分的結(jié)構(gòu)，并且縮短了提取時間，提高得率，為植物成分的提取提供了快速、高產(chǎn)的新方法［7－9］。影響超聲波提取工藝的因素較多［10－11］，本試驗以紫葡萄皮為原料，采用響應(yīng)面設(shè)計方法（response surface design，RSD），對超聲功率、超聲溫度、超聲時間、超聲頻率等因素進行優(yōu)化，以提高超聲輔助萃取紫葡萄皮花色苷產(chǎn)率，為紫葡萄皮及花色苷的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)提供重要的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紫葡萄，購自杭州市農(nóng)貿(mào)市場，無水甲醇、濃鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉均為分析純試劑。

1.2 實驗儀器

超聲波藥品處理機（JBT/C－YCL400T/3P（D）），離心機（KQ3200B），紫外可見分光光度計（UV－7504C），溫度計，容量瓶，三口燒瓶，量筒，玻璃棒，藥匙，鐵架臺，移液管，滴定管等。

1.3 RSD優(yōu)化提取超聲工藝設(shè)計

在前期研究基礎(chǔ)上，確定超聲波的功率（額定功率，154～286W）、溫度（30～50℃）、頻率（25～70kHz）和時間（25～45min）對紫葡萄皮花色苷的提取影響較大。以70%乙醇為萃取溶劑，應(yīng)用Box－Behnken中心組合進行四因素三水平的實驗設(shè)計（取α＝2），見表1。以花色苷的吸光值為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化葡萄皮花色苷超聲波提取條件。

表1 實驗因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4 花色苷的測定

采用pH示差法測定花色苷總量［11］。確定兩個對花色苷吸光度差別最大但使花色苷穩(wěn)定的pH值，因葡萄皮花青素在pH1.0和pH4.5處的吸光值差是極大［12］，故選定pH1.0和pH4.5兩個pH值測定花色苷的吸光值。

將提取液分別用兩組緩沖溶液稀釋10倍，靜置2h，測定其在520nm和700nm處的吸光值。

pH4.5的緩沖液V（1NNaAc）∶V（1NHC1）∶V（H2O）＝100∶60∶90；

pH1.0的緩沖液V（0.2NKCl）∶V（0.2NHCl）＝25∶67。

花色苷吸光值＝（Aλ520pH1.0－Aλ700pH1.0）－（Aλ520pH4.5－Aλ700pH4.5）

根據(jù) T.Fuleki［12］的研究，計算方法如下：

式中：ΔA＝ （A520－A700）pH1.0－ （A520－A700）pH4.5；V— 花色苷溶液體積，mL；F— 稀釋倍數(shù)；avE1%1cm—平均消光系數(shù)，98.2［13］；m— 鮮葡萄皮質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上對四因素進行二次回歸設(shè)計試驗和分析，吸光值為響應(yīng)值，實驗采用Box－Behnken中心組合設(shè)計，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計實驗及結(jié)果Table 2 Response surface design and results of experiments

經(jīng)Minitab軟件回歸擬合后，各實驗因子響應(yīng)值的影響可用上述四元三次回歸方程表示。從表3中可以看出，用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值的關(guān)系時，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性、平方及交互作用關(guān)系都是顯著的，R－Sq＝96.23%，模型的響應(yīng)值的變化有96.23%來自所選因子，即超聲功率、超聲溫度、超聲頻率、超聲時間4個因素可以很好地解釋模型變化。

根據(jù)回歸方程，可以利用Minitab軟件繪出曲面圖和等值線圖，見圖2至圖7。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時其余變量保持在最佳水平。由響應(yīng)面圖可以看出所選因子對花色苷提取的相關(guān)性。從圖中還可以看出，超聲功率及其平方項，超聲溫度、超聲頻率的平方項及超聲功率與超聲時間的交互項對花色苷提取極顯著，各單因素對花色苷提取的影響依次為超聲功率＞超聲時間＞超聲溫度＞超聲頻率。

表3 回歸分析Table 3 Analysis of regression

圖2 Y＝f（A，B）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.2 Response surface and contour results of Y＝f（A，B）

圖3 Y＝f（A，C）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.3 Response surface and contour results of Y＝f（A，C）

圖4 Y＝f（A，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.4 Response surface and contour results of Y＝f（A，D）

圖5 Y＝f（B，C）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.5 Response surface and contour results of Y＝f（B，C）

圖6 Y＝f（B，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.6 Response surface and contour results of Y＝f（B，D）

圖7 Y＝f（C，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.7 Response surface and contour results of Y＝f（C，D）

根據(jù)Minitab的響應(yīng)優(yōu)化器分析可以得圖8，由復(fù)合意合性可知設(shè)置能夠為所有響應(yīng)獲得一個較好的結(jié)果，即評定總得分的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲功率286W，超聲溫度為45.2℃，超聲頻率為48.8kHz，超聲時間為45min。理論花色苷的得率為0.248 8g/100g。

圖8 最優(yōu)水平分析Fig.8 Analysis of optimal level

實驗中采用超聲波功率286W，超聲溫度45℃，超聲頻率45kHz，超聲時間為45min，萃取紫葡萄皮花色苷，得率為0.235g/100g。

3 結(jié) 語

利用響應(yīng)面設(shè)計分析得出，紫葡萄最優(yōu)提取工藝為超聲功率286W，超聲溫度為45.2℃，超聲頻率為48.8kHz，超聲時間為45min，花色苷得率為0.235g/100g。

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