王峻 孟麗娟 樊衛(wèi)飛 蒲驍麟 王琳 許林

小細胞肺癌(SCLC)是一種高度侵襲性疾病，其發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)。miRNAs 是一類最新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，主要通過與靶標基因3'UTR 的完全或不完全配對，降解靶基因mRNA 或抑制其翻譯，發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能。miR-17-5p 是miR-17-92 簇7 成員之一。p53 是迄今為止最重要的抑癌基因。本文探討了SCLC 中的miR-17-5p 的表達情況及與p53 蛋白表達的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 66 例SCLC 患者，20 例局限期，46 例廣泛期。其中，男45 例，女21 例，年齡43 ～72 歲，平均(55.3 ±4.6)歲。均接受依托泊苷+鉑類(EP)方案化療，4 例局限期患者化療后接受放療治療。所有病例均為淋巴結(jié)組織活檢標本。

1.2 實驗試劑和儀器 石蠟包埋組織總RNA 提取試劑盒(RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit，ABI公司);RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-GreenⅠ熒光試劑盒(miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR，Exiqon公司);hsami-17-5p 引物、內(nèi)參U6 snRNA 系Exiqon 公司合成;p53 單克隆抗體、EnVision 試劑盒［基因科技(上海)公司］。酶標儀(DU-600 型，Beckman 公司);ABI 7500 Real-time PCR 儀(Ambion 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR 法檢測miR-17-5p

1.3.1.1 RNA 提取:從66 例存檔石蠟組織塊中隨機抽取25 例形態(tài)學(xué)正常的癌旁組織。石蠟組織重新切片:≥10 μm 的連續(xù)切片。取≤80 μm 的石蠟組織切片，常規(guī)脫蠟、蛋白酶消化，按照試劑盒說明書操作步驟提取總RNA;紫外分光光度計檢測RNA 溶液A260、A280吸光值，A260/A280比值介于1.8 ～2.0 方可用于cDNA 合成。應(yīng)用2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性，RNA 存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2cDNA 合成:所有模板RNA 濃度調(diào)至110 ng/μl，反應(yīng)體系20 μl:5 ×反應(yīng)緩沖液4 μl;混合酶2 μl;去核酸酶H2O 10 μl;模板RNA 4 μl;反應(yīng)條件為:42 ℃作用60 min 后，95 ℃5 min。

1.3.1.3 PCR 擴增:特定加尾結(jié)構(gòu)的hsa-miR-17-5p 引物序列為CAAA GUGC UUAC AGUGCAGG UAG，以第一鏈cDNA 為模板，反應(yīng)在ABI 7500 real-time PCR 儀上完成。PCR 擴增體系:cDNA 8 μl，SYBR Green master mix 10 μL，PCR mix 2 μl 共20 μl;反應(yīng)條件:50 ℃2 min后，95 ℃預(yù)變性10 min，隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)40 個循環(huán)。

1.3.1.4 Ct 值計算:記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct 值，以U6 snRNA 作為內(nèi)參照，采用定量PCR 中的相對定量法，以2－ΔCt表示腫瘤組織目的基因的表達相對于U6 的變化倍數(shù):△Ct=CtmiR-17-5p-Ctu6。

1.3.2 EnVision 法檢測p53 蛋白表達:p53 蛋白表達采用EnVision 法檢測。實驗步驟按說明書進行。免疫組化判斷標準:p53 蛋白以細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數(shù)＞10 為陽性，＜10 為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)處理。率的比較釆用卡方檢驗。相關(guān)分析采用列聯(lián)相關(guān)分析法。雙側(cè)檢驗P ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-5p 在SCLC 及癌旁組織中的表達情況實時定量RT-PCR 法檢測隨機抽取的20 例SCLC 淋巴結(jié)組織及相應(yīng)癌旁組織，結(jié)果顯示miR-17-5p 在SCLC中的平均表達量為2.81 ±0.38，而在癌旁組織中的表達量為1.07 ±0.58，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。63.3%(42/66)的患者miR-17-5p 表達升高，其高表達與VALSG 分期及吸煙狀態(tài)有關(guān)(P ＜0.05)，而與年齡及性別無關(guān)(P ＞0.05)，見表1。

2.2 p53 蛋白在SCLC 中的表達情況 p53 蛋白在66例SCLC 組織中的陽性表達率為60.6% (40/66)，與臨床特征比較，其陽性表達與VALSG 分期及吸煙狀態(tài)有關(guān)(P ＜0.05)，而與年齡及性別無關(guān)(P ＞0.05)，見表1。

表1 miR-17-5p 表達及p53 蛋白表達與臨床特征的關(guān)系(n)

2.3 miR-17-5p 表達與p53 蛋白表達之間的相關(guān)性miR-17-5p 表達增高者42 例，其中39 例p53 蛋白表達陽性，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，二者顯著相關(guān)(r =0.67，P ＜0.05)。

3 討論

SCLC 約占肺癌的15%，其發(fā)病與吸煙顯著相關(guān)。根據(jù)美國退休軍人醫(yī)院的分期方法(VALSG)，SCLC被分為局限期和廣泛期，預(yù)后差。若未經(jīng)治療，局限期患者預(yù)計壽命大約為3.5 月，廣泛期大約為6 周［1-2］。

研究顯示，miR-17-92 簇失調(diào)在肺癌中起重要作用。miR-17-92 簇包含7 成員:miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1 和miR-92-1。Hayashita 等［3］發(fā)現(xiàn)在肺癌尤其是SCLC 中miR-17-92簇過度表達。Matsubara 等［4］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗miR-17-5p和miR-20a 反義寡核苷酸抑制miR-17-5p 和miR-20a，可以誘導(dǎo)miR-17-92 簇過度表達細胞的凋亡。同時，Cloonan 等［5］的研究表明在細胞龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-17-5p 是調(diào)節(jié)細胞周期G1/S 轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子。

p53 基因定位于人染色體17p13.1，是與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，約一半的腫瘤與之相關(guān)。p53基因是抑癌基因，是監(jiān)視基因組的完整性和修復(fù)DNA損傷的重要基因［6］。野生型p53 通過點突變轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚿53，隨之編碼的蛋白失去了腫瘤抑制功能，從而參與腫瘤發(fā)病。一般認為用免疫組織化學(xué)方法檢測到的p53 即為突變型p53 蛋白。多項研究表明p53 蛋白的表達與SCLC 發(fā)病密切相關(guān)［7-8］。p53 蛋白與SCLC的預(yù)后存在爭議。一些研究認為p53 突變與預(yù)后無關(guān)［9-10］;另一些研究認為p53 的表達與化療效果差相關(guān)［11-12］。

在缺氧誘導(dǎo)凋亡的研究中，Yan 等［13］發(fā)現(xiàn)在野生型p53 細胞中，缺氧情況下miR-17-92 簇的表達下降;而突變型p53 細胞中，缺氧不能誘導(dǎo)miR-17-92 簇表達的改變。進一步研究顯示miR-17-92 啟動子近端區(qū)域內(nèi)p53 結(jié)合位點調(diào)控p53 基因表達。而miR-17-92簇的過表達可顯著抑制細胞誘導(dǎo)的凋亡，抑制miR-17-5p 和miR-20a 表達可恢復(fù)細胞對缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)SCLC 中miR-17-5p 表達升高，顯著高于癌旁組織。63.3%的患者miR-17-5p 表達升高，同時，p53 蛋白的陽性表達率為60.6%，相關(guān)性分析顯示兩者顯著相關(guān)。兩者均與VALSG 臨床分期及吸煙狀態(tài)有關(guān)，而與年齡及性別無關(guān)。提示，miR-17-5p 在SCLC 中表達升高并與p53 蛋白表達的密切相關(guān)。但本研究樣本量尚小，仍需大樣本的研究結(jié)果進一步佐證。

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