施潔 唐曦 葛偉 侯立皓 婁青林 歐陽鋼

絕經(jīng)后骨質疏松癥是絕經(jīng)后婦女的常見病和多發(fā)病，因骨丟失所造成的病理性骨折的增加，嚴重損害著老年婦女的健康。目前對骨質疏松的防治研究已經(jīng)成為醫(yī)學研究的重要課題。近年來，針灸治療骨質疏松在臨床上取得了良好的療效，可明顯改善骨質疏松患者的臨床癥狀，提高患者骨密度，延緩骨量的丟失［1-2］，但有關針灸防治骨質疏松癥的機制目前仍不清楚。本實驗以切除大鼠卵巢制作絕經(jīng)后骨質疏松癥模型，觀察電針對去卵巢大鼠骨組織形態(tài)學的影響，以探討針灸抗骨質疏松的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取60 只3 月齡SD 雌性清潔性大鼠，體質量180 ～200 g。未曾交配，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物使用許可證號為:SCXK(滬)2007-0005。動物適應飼養(yǎng)1 周后，隨機分成A、B 2 組，其中A 組為假手術組，共20 只，不切除雙側卵巢;B 組為模型組，共40 只，切除雙側卵巢，手術操作同A 組。3 月后2 組各取10 只大鼠進行骨密度檢測確定造模是否成功［3］。造模成功后處死，提取骨標本保存。將A 組余下的10 只大鼠設為假手術組;B 組余下的30 只大鼠隨機分為模型組、針刺組和雌激素組，每組各10 只。

1.2 動物造模制作 用3%戊巴比妥鈉(按0.1 ml/100 g)經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉后，于背部正中切口進入腹腔背側，完整摘除雙側卵巢后，仔細止血，逐層縫合。假手術組取腰椎旁背側切口，進入腹腔，切除一段小腸系膜后，立即止血縫合。動物手術后給予抗生素3 d，防止感染，自由攝食，飲水。

1.3 治療方法

1.3.1 針刺組:大鼠不作麻醉，在自己設計的鼠架上進行針灸操作。選穴:(1)關元、三陰交(雙側);(2)腎俞、后三里(雙側)，每日選取其中1 組穴位，2 組穴位交替進行，取穴方法按華興邦氏的方法實施，用細美容針刺入穴位后，接韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)進行電針刺激，其刺激參數(shù)為:連續(xù)脈沖波、頻率3 ～4 Hz、強度4 ～5 mA，以動物局部輕度抖動為度，每次20 min，每日1 次，連續(xù)治療3 月。

1.3.2 雌激素組:造模成功后，按人鼠劑量換算，每只大鼠以0.1 mg/kg，皮下注射苯甲酸雌二醇，每周1 次，連續(xù)3 月。

1.3.3 假手術組與模型組:不作任何處理。

1.4 骨組織形態(tài)計量學觀察

1.4.1 四環(huán)素活體標記與不脫鈣切片制作［4-5］:大鼠處死前14 d 腹腔內注射1%四環(huán)素生理鹽水30 mg/kg，處死前4 d 腹腔內注射1% 鈣黃綠素5 mg/kg，進行活體熒光標記。3 月后，用10 g/L 的戊巴比妥鈉麻醉并斷頭處死大鼠，取其左側股骨下段干骺端長約1 cm 骨組織，置于4 ℃70%乙醇中固定，再經(jīng)梯度酒精、丙酮脫水、脫脂，將標本經(jīng)二甲苯透明后浸透包埋于甲基丙烯甲酯、丁酯及過氧化苯乙酰的聚合物中，置于4 ℃冰箱中聚合，用Jung K 型重型切骨機切成8 μm 的厚骨片(用于測量松質骨動態(tài)參數(shù))和4 μm 的薄骨片(用于測量松質骨靜態(tài)參數(shù))。薄片行von Kossa 及Giemsa 染色封片，厚片不染色作熒光觀察。

1.4.2 骨組織觀察及測量參數(shù):采用半自動數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)和測量軟件(OsteoMeasure;OsteoMetrics，Inc，USA)在距骺線1 mm 處至遠端3 mm 范圍內進行松質骨的骨形態(tài)計量學參數(shù)測量。測量的指標有:靜態(tài)參數(shù):(1)骨小梁面積分數(shù)(Tb. Ar);(2)骨小梁數(shù)(Tb.N);(3)骨小梁寬度(Tb.Wi);(4)骨小梁分離度(Tb.Sp)。動態(tài)參數(shù):(1)熒光周長百分率(L. Pm);(2)礦化沉積率(MAR);(3)礦化延遲時間(MLT);(4)類骨質周長百分率(O.Pm);(5)骨吸收周長百分率(Er.Pm);(6)骨形成率(BFR/BS)各參數(shù)意義及相關計算公式見文獻［6］。

1.5 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 11.0 進行統(tǒng)計學分析，結果以±s 表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK 法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針對去卵巢大鼠骨形態(tài)靜態(tài)參數(shù)的影響 切除大鼠雙側卵巢后，模型組Tb.Ar，Tb.N 及Tb.Wi 均顯著減少，Tb.Sp 明顯增加，與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異(P ＜0.01)。提示模型組大鼠在去勢后骨量顯著下降，骨小梁間結構破壞，骨質疏松形成。見表1。經(jīng)3 月連續(xù)治療后，與模型組相比，電針組和雌激素組Tb. Ar，Tb. Wi 的水平均有不同程度的提高，而Tb.Sp 均有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，且在雌激素組中Tb. N 與模型組相比亦有顯著增加(P ＜0.05)。電針組中Tb.Ar，Tb.Wi 顯著低于雌激素組，而Tb.Sp 則明顯高于雌激素組，且均有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組骨形態(tài)計量學靜態(tài)指標(±s，n=10)

表1 各組骨形態(tài)計量學靜態(tài)指標(±s，n=10)

注:與假手術組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與雌激素組比較，▲P ＜0.05

組別Tb.Ar(%)Tb.Wi(μm)Tb.N(個/μm)Tb.Sp(μm)假手術組37.43 ±5.8782.54 ±9.734.11 ±0.43218.80 ±151.89模型組20.66 ±4.54＊＊56.07 ±10.2＊＊1.07 ±0.56＊＊592.63 ±166.02＊＊雌激素組27.19 ±4.01＊＊△△77.13 ±9.43△1.98 ±0.73＊＊△228.58 ±113.44＊＊△△電針組25.39 ±2.82＊＊△▲67.13 ±6.48＊＊1.61 ±0.59＊＊411.80 ±144.48＊＊△▲

2.2 電針對去卵巢大鼠骨形態(tài)動態(tài)參數(shù)的影響 切除大鼠雙側卵巢后，與假手術組相比，模型組L. Pm、MAR、O. Pm 及Er. PM、BFR/BS 均顯著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，MLT 明顯縮短(P ＜0.05)。表明模型組大鼠去勢后，新骨形成和礦化的速率加快，骨轉化活躍，骨形成與骨吸收都增強，呈現(xiàn)高代謝狀態(tài)。

經(jīng)3 月連續(xù)治療后，電針組L.Pm、MAR 均有明顯升高，Er.PM、MLT 下降明顯，與模型組相比，有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)，而O.Pm 和BFR/BS 較模型組而言，變化不明顯;雌激素組中，與模型組相比，L.Pm、MAR均有所下降(P ＜0.01)，Er.PM、BFR/BS 也明顯減少(P ＜0.01)，而O.Pm、MLT 則無統(tǒng)計學差異。電針組中L.Pm、MLT、BFR/BS 較雌激素組明顯升高，而MLT 則顯著下降(P ＜0.01)。見表2。

表2 各組骨形態(tài)計量學動態(tài)指標(±s，n=10)

表2 各組骨形態(tài)計量學動態(tài)指標(±s，n=10)

注:與假手術組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05 ，△△P ＜0.01;與雌激素組比較，▲▲P ＜0.01

項目L.Pm(%)O.Pm(%)Er.PM(%)10.31 ±5.6220.46 ±3.1211.53 ±3.12模型組16.69 ±6.32*28.11 ±4.33*17.62 ±4.18＊＊雌激素組7.81 ±4.29△△24.34 ±5.5712.97 ±4.23△△電針組25.15 ±6.71＊＊△▲▲26.78 ±3.34＊＊14.84 ±3.56假手術組＊△項目MAR(μm/d)MLT(d)BFR/BS(%)0.98 ±0.137.07 ±0.979.16 ±2.23模型組1.13 ±0.11*6.13 ±0.54*16.07 ±3.25＊＊雌激素組0.76 ±0.16＊＊6.52 ±0.8110.71 ±1.97電針組1.36 ±0.23＊＊△△▲▲4.16 ±0.76＊＊△△▲▲18.97 ±3.13假手術組＊＊△△▲▲

2. 3 各組大鼠骨組織形態(tài)學表現(xiàn) 假手術組骨小梁較粗，排列密集而整齊，連續(xù)性好(圖1)。模型組去勢后骨小梁排列稀疏，骨小梁間連接差，出現(xiàn)大量骨小梁盲端(圖2)。經(jīng)電針治療后，骨小梁密度增大，骨小梁數(shù)目增加，但仍不如正常結構，小梁間連接性差(圖3)。經(jīng)雌激素治療后，骨小梁數(shù)目增加，小梁間連接增多，排列有序，仍未達正常結構(圖4)。

3 討論

骨組織形態(tài)計量學是利用體視學原理，將形態(tài)學觀察到的骨組織結構改變用定性、定量的計量方法進行計算［7］。不僅能夠精確地測量骨組織微細結構和骨組織形態(tài)學及總體骨量的變化，而且能夠通過“四環(huán)素標記”的骨計量學技術將時間因素標記在骨形成期的礦化過程，能動態(tài)觀察到完整的激活-吸收-形成-靜止過程的改變，了解其產(chǎn)生結構差異的根本原因與代謝的信息狀況［8］。因此在疾病的發(fā)生機制研究、藥物療效的評價中都有著廣泛的應用價值［9］。將骨組織形態(tài)計量學運用于針刺研究中，不僅能從靜態(tài)參數(shù)中對骨組織水平的質(骨結構)和量(骨量)進行客觀評價，而且可以通過測量其動態(tài)參數(shù)，了解骨組織形態(tài)細胞水平的動態(tài)特性，因此，骨組織形態(tài)計量學對客觀評價針灸治療骨質疏松癥的效果，進一步闡明針灸抗骨質疏松癥的可能作用機制均提供了一個很好的研究手段。

本次實驗采用摘除大鼠雙側卵巢的方法復制骨質疏松模型，因其骨量丟失與絕經(jīng)后婦女相似，國內外報道均認為是比較合適的［10-11］。在本實驗中，模型組與假手術組相比，其骨量明顯下降，骨小梁形態(tài)結構發(fā)生明顯變化。從動態(tài)參數(shù)分析，骨吸收活動增強，破骨細胞功能增強，同時機體通過破骨-成骨偶聯(lián)作用，使成骨細胞活性增強，數(shù)量明顯增多，分泌類骨質功能增強。這些變化顯示模型組大鼠去卵巢后呈現(xiàn)較高的骨轉換率，骨吸收和骨形成均增強，但骨吸收大于骨形成，致大鼠股骨骨量下降，骨結構稀疏，骨質疏松形成，造模成功。

中醫(yī)認為腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，為氣血生化之源，脾腎兩臟與骨質疏松關系密切，故以補腎健脾為治療原則，選取腎俞、后三里、關元、三陰交等穴［12］。經(jīng)電針治療后，從動態(tài)參數(shù)上看，與模型組比較，L.Pm 增加顯著，說明電針能夠刺激成骨細胞的生成，加速骨的形成。MAR 增加，MLT 減少表明電針能使成骨細胞活性增加，礦化功能增強，BFR/BS 與模型組相比雖然其差異無顯著性，但亦有一定程度的提高，表明骨形成增加。在骨吸收方面，Er.Pm 比模型組明顯減少，表明破骨細胞功能受到一定抑制，其活性減低，致使骨吸收下降。從靜態(tài)參數(shù)上看，與模型組比較，電針組Tb.Wi 明顯提高，Tb.Sp 顯著減小，Tb.N 與模型組相比雖然沒有統(tǒng)計學意義，但整體也有增加的趨勢，表明骨小梁間形態(tài)結構得到改善，Tb.Ar 較模型組也有明顯增加，骨量得到維持。由上述分析可知，電針能夠增加成骨細胞數(shù)目和活性，促進骨形成，并且對破骨細胞起到一定抑制作用，使骨吸收減弱，從而達到防治骨質疏松的目的。

雌激素是治療絕經(jīng)后骨質疏松癥確切有效的藥物［13］，本次實驗采用雌激素作為對照，旨在比較針刺與藥物在治療骨質疏松癥療效及作用機制上的差異。本次實驗結果與以往報道的相同［13］，雌激素對絕經(jīng)后骨質疏松癥的治療作用是通過降低高骨轉換率，即同時減緩骨吸收和骨形成(以抑制骨吸收為主)，從而糾正骨代謝負平衡，達到減少骨量丟失，改善骨結構的目的。

綜上所述，電針能明顯改善去卵巢大鼠骨質疏松癥的骨組織形態(tài)學指標，通過抑制骨吸收，促進骨形成，使骨形成大于骨吸收而呈正平衡狀態(tài)，從而使骨量和骨結構明顯改善，達到防治骨質疏松的目的。

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