劉源崗，鄭琪瑤，王士斌

（1 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2 華僑大學制藥工程研究所，福建 廈門 361021）

多囊脂質體（multivesicular liposomes，MVLs）是采用儲庫泡沫技術制備的一種結構特殊的新型脂質體，其內部不連續(xù)的水性內腔被非同心的類脂以及磷脂膜所分隔，形成許多細微的囊泡[1-2]。傳統(tǒng)的單層和多層脂質體為同心囊結構，膜一旦破裂，藥物即漏出；MVLs 具有不連續(xù)的囊泡，當某個囊泡破裂時，藥物只從破裂的囊泡中釋出，仍可保持完整的囊泡狀態(tài)，因而具有良好的緩釋效應（圖1）[3]。由于粒徑較大（1～100 μm），可通過鞘內、皮下、腹腔、肌肉、眼內、動脈栓塞、瘤體內給藥等多種途徑注射給藥，給藥后大部分停留在靶部位，為藥物的緩釋提供儲庫作用[4-5]。由于內水相體積較大，尤其適用于包封水溶性小分子和生物活性大分子藥物[6-8]。

圖1 脂質體結構示意圖

鹽酸米托蒽醌（mitoxantrone hydrochloride ，DHAD）是蒽二酮類的合成抗腫瘤藥物，分子量為517.41 Da，親水性強且?guī)д姾?。其抗癌活性與阿霉素相似或略高，明顯高于環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、甲氨喋呤、氟尿嘧啶和長春新堿等常用的抗癌藥物。然而，DHAD 進入血液后大部分（95% 以上）迅速與血漿蛋白結合，造成了嚴重的毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應及心臟毒性[9]。為了拓寬其臨床應用，研究者制備了各種載體（如脂質體、納米載體）[10-11]，但是由于DHAD 為小分子藥物，載體包封率通常較低（＜ 40%）[12]或釋放時間較短（＜ 50 h）[13]。利用DHAD 的正電荷特性，制備陰離子型載體可大幅提高包封率，延長釋放時間[14]。但是，對于中性載體，如何獲取高包封率同時具有較長的釋放時間是一個問題。

因此，可以利用MVLs 的特殊結構特征，制備DHAD-MVLs 復合物，用以獲得可用于原位注射給藥的DHAD 載體。實驗采用均勻設計優(yōu)化了制備工藝，考察了DHAD-MVLs 的形貌、粒徑及其分布、Zeta 電位、相變溫度、滲漏率、包封率、體外釋放等指標，以期提供一種新的DHAD 藥物載體形式。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

大豆卵磷脂（≥96%，德國Lipoid 公司）；鹽酸米托蒽醌（DHAD，≥99%，大連美侖生物技術有限公司）；蔗糖（分析純，汕頭市達濠精細化學品公司）；三油酸甘油酯和Triton X-100 為化學純，其它試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

BS210S 電子分析天平（德國Sartorius）；T25高速勻漿機（德國IKA）；QL-901 旋渦混懸儀（海門其林貝爾）；NE-1001 旋轉蒸發(fā)儀（日本EYELA）；BH-2 生物顯微鏡（日本Olympus）；UV-1600PC 紫外分光光度計（上海美譜達）；TGL-18M 臺式高速冷凍離心機（湖南凱達）；FDU-2100 冷凍干燥機（日本東京理化器械）；Mastersizer 2000 激光粒度儀（英國馬爾文）；ZetaPALS Zeta 電位儀（英國馬爾文）；DSC2910 差示掃描量熱儀（美國TA）；ZHWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠）。

1.2 空白多囊脂質體（MVLs）的制備及工藝優(yōu)化

配制內水相（含蔗糖）、外水相（含葡萄糖和L-賴氨酸）及油相（含大豆卵磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯和油酸，二氯甲烷為溶劑）。取一定體積油相溶液和內水相溶液混勻，于高速勻漿機上攪拌10 min，轉速為20000 r/min，制備初乳。然后向初乳中加入外水相溶液，于旋渦混懸儀上乳化10 s，制備復乳。隨后將復乳轉移至旋蒸瓶中，于35 ℃，10 r/min 的條件下旋轉蒸發(fā)，除去有機溶劑，即得多囊脂質體懸液。

選取包封率為指標，選擇大豆磷脂的濃度、膽固醇濃度、三油酸甘油酯濃度、L-賴氨酸的濃度、油相/內水相體積比和初乳/外水相體積比6 個處方因素進行均勻設計實驗（表1）。按照均勻設計實驗和DPS 數據分析得出的最優(yōu)條件制備多囊脂質體，檢驗所建模型是否正確。

1.3 載DHAD 多囊脂質體的制備

DHAD 多囊脂質體（DHAD-MVLs）制備方法同上，采用優(yōu)化后的制備工藝，其中內水相含0.5 mg/mL DHAD。

1.4 多囊脂質體形貌、粒徑及Zeta 電位表征

取適量MVLs及DHAD-MVLs懸液至光鏡下觀察并拍照。另取適量脂質體懸液，分散于去離子水中，用激光粒度儀測定其粒度分布及平均粒徑。取離心后的脂質體，用外水相重新分散，于Zeta 電位儀上測定脂質體的表面電位。

1.5 相變溫度測定

取適量大豆磷脂、MVLs 和DHAD-MVLs 的凍干粉末，于差示掃描量熱儀上測其相轉變溫度。大豆磷脂的測試條件為-30～50 ℃，空白脂質體和載藥脂質體的測試條件為10～70 ℃，升溫速度均為5 ℃/min。

1.6 藥物滲漏率測定

1.6.1 DHAD 穩(wěn)定性考察

配制0.01 mg/mL的DHAD溶液，分別放于4 ℃和37 ℃搖床中，在兩種環(huán)境下放置生理鹽水溶液作為參比液，于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 取出一定的溶液測定吸光度，做DHAD 的濃度對應不同時間點曲線圖，反映其穩(wěn)定性。

1.6.2 藥物滲漏率考察

樣品置于4 ℃和37 ℃，于一定時間（12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 和144 h）測定脂質體包封率的變化，計算藥物的滲漏率，繪制滲漏率隨時間變化的曲線。藥物的滲漏率按下式計算

1.7 體外緩釋性能考察

將制備的脂質體，離心取沉淀，用適量生理鹽水將脂質體重懸。在低速磁力攪拌下，分別取5 mL脂質體懸液到已編號（1～15）的15 mL 的離心管內，另加5 mL 生理鹽水作為釋放介質。將離心管放于37℃，30 r/min 的搖床中，分別于設定的時間點（0.5 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h，84 h，96 h，108 h 和120 h）取出同一編號的15 mL 離心管，2500 r/min 離心10 min后用生理鹽水重懸，再次離心洗滌。棄去上清液，加入50 g/L 的Triton X-100 乙醇溶液破囊，測其在663 nm 處的吸光值，計算釋放百分率并繪制釋放曲線。藥物的累積釋放率（%）按下式計算

式中，Q0為釋放開始前脂質體包封的藥量；Qt為t 時刻脂質體中剩余的藥量。

分別制備不同膽固醇用量（4 mg/mL，12 mg/mL，20 mg/mL）及三油酸甘油酯用量（4 mg/mL，12 mg/mL，20 mg/mL）的多囊脂質體，考察膽固醇用量及三油酸甘油酯對脂質體釋放性能的影響。

2 結果與討論

2.1 多囊脂質體的制備工藝優(yōu)化

均勻設計實驗結果如表1 所示。利用DPS 軟件對實驗結果進行二次多項式逐步回歸，得到回歸方程：Y=43.35+139.03X6-0.36X52-101.90X62+0.26X2X5- 3.67X3X6+0.04X1X4（R=0.935，F=8.40，P= 0.011）。方程通過F 值檢驗，具有顯著性，可以通過目標函數進行優(yōu)化和預測。用DPS 軟件進行二次多項式回歸分析，尋找目標函數為最大值時的各變量的值。DPS 軟件的輸出結果如表2 所示。

根據上述分析結果并結合實際情況，選擇以下條件進行驗證實驗：大豆磷脂濃度16 mg/mL，膽固醇濃度12 mg/mL，三油酸甘油酯濃度12 mg/mL，L-Lys 濃度40 mmol/L，油相/內水相體積比1∶1，初乳/外水相體積比2∶3，內水相蔗糖濃度50 g/L，外水相葡萄糖濃度75 g/L，以二氯甲烷為有機溶劑制備三批多囊脂質體，并測定鹽酸米托蒽醌的包封率，結果分別為88.63%、91.26%和90.51%，平均包封率為90.13%，接近預測值89.10%，且高于均勻設計各實驗組包封率。因此，經過均勻設計優(yōu)化制備工藝，脂質體的包封率得到了較大的提高。

表1 均勻設計實驗表

表2 DPS 回歸分析結果

2.2 多囊脂質體形貌、粒徑及Zeta 電位

由圖2(a)可知，制備的脂質體呈卵形或圓形，內部的多囊泡結構中包封有大量的鹽酸米托蒽醌溶液?？瞻字|體（MVLs）和鹽酸米托蒽醌多囊脂質體（DHAD-MVLs）的平均粒徑分別為59.78 μm和58.75 μm，粒徑跨距分為1.44 和1.10。鹽酸米托蒽醌脂質體的粒度分布較窄，粒度趨于均勻[圖2(b)]。MVLs 和DHAD-MVLs 的Zeta 電位分別 為-45.6 mV 和-47.1 mV，均為穩(wěn)定體系，可見鹽酸米托蒽醌的加入沒有降低脂質體的穩(wěn)定性。

2.3 相變溫度

相變溫度是磷脂膜從膠晶相向液晶相轉變時的臨界溫度。當周圍溫度在脂質體相變溫度以下時，脂質雙分子層排列緊密，流動性小，藥物滲漏較小，而隨著溫度升高，脂質膜發(fā)生相變，膜的橫切面增大，通透性和流動性增大，藥物會加速從脂質體中滲漏，因此，相變溫度是衡量脂質體穩(wěn)定性的一個重要參數。由圖3(a)、(b)可見，空白多囊脂質體相 轉變溫度為39.2 ℃，載藥多囊脂質體的相轉變溫度為38.8 ℃，并無明顯差異。由圖3(c)，天然大豆磷脂的相轉變溫度為-23 ℃，與圖3 (a)、(b)比較可知，膽固醇的加入在很大程度上提高了脂質體的相變溫度，起到了穩(wěn)定脂質膜的作用。

圖2 DHAD-MVLs 的形貌和粒徑分布

2.4 藥物滲漏率

如圖4 所示，鹽酸米托蒽醌在4 ℃和37 ℃環(huán)境下，72 h 內的吸光值基本穩(wěn)定，具有良好的穩(wěn)定性，說明在本實驗環(huán)境下進行藥物的包封和釋放的考察是可行的，可以利用分光光度法測定鹽酸米托蒽醌的含量。

此外，脂質體懸液于37 ℃和4 ℃保存時，168 h的滲漏率分別為55.9%和23.68%，脂質體懸液在兩種條件下保存時藥物均有一定程度的滲漏。由圖5 可知，脂質體在4 ℃環(huán)境保存時，脂質體的滲漏率較低，且隨時間增大的趨勢較緩。

圖3 MVLs、DHAD-MVLs 和大豆磷脂的差熱分析

圖4 DHAD 在不同溫度下的穩(wěn)定性

圖5 不同溫度對脂質體懸液滲漏率的影響

2.5 體外釋放

由圖6 可知，鹽酸米托蒽醌能夠從多囊脂質體中緩慢釋放。膽固醇的用量分別為4 mg/mL、12 mg/mL 和20 mg/mL 時，多囊脂質體在前0.5 h 內的藥物釋放量分別為23.43%、13.02%和10.27%，均低于40%，沒有明顯的突釋現象。膽固醇用量過高（20 mg/mL）或過低（4 mg/mL）都會導致藥物加速從脂質體中釋放。當膽固醇用量為4 mg/mL 時，鹽酸米托蒽醌在60 h 左右就釋放了90%以上。在120 h 時，12 mg/mL 和20 mg/mL 組的藥物釋放量分別為80.68%和83.04%，符合《藥典》的規(guī)定。分析認為，膽固醇具有調節(jié)膜流動性的作用，加入適量的膽固醇可以提高脂質膜的穩(wěn)定性，使藥物的釋放速率減緩，而過量的膽固醇反而可能會增加膜的剛性而導致脂質膜更加容易破裂[15-16]，從而導致藥物加速釋放。

圖6 膽固醇用量對脂質體釋放性能的影響

圖7 三油酸甘油酯用量對脂質體釋放性能的影響

由圖7 可知，不同三油酸甘油酯用量的脂質體也能實現藥物的緩慢釋放，前0.5 h 時，4 mg/mL、 12 mg/mL 和20 mg/mL 組的脂質體的釋藥量分別為11.55%、13.25%和12.04%，均無突釋現象。120 h時，三組的藥物累積釋放量分別為74.16%、82.98%和87.04%。因此，降低三油酸甘油酯的用量有利于提高多囊脂質體的緩釋效果。分析認為，三油酸甘油酯主要起架橋、連接和穩(wěn)定多囊脂質體內部囊泡的作用。張淼等[17]報道，甘油三酯的碳鏈長度對脂質體的釋放速率有很大的影響。實驗中所用的三油酸甘油酯為烷基鏈長為18C 的長鏈甘油三酯，具有較好的緩釋效果，但是過多的三油酸甘油酯會以小液滴的形式存在于內水相中，可能會改變內水相的酸堿度且會破壞脂質體內外水相的滲透壓，從而降低緩釋效果。

3 結 論

通過實驗優(yōu)化了載鹽酸米托蒽醌多囊脂質體的制備工藝，所制得的MVLs 粒徑分布均勻、球形度及穩(wěn)定性良好；考察了體系的相變溫度、滲漏率及不同因素對多囊脂質體緩釋性能的影響。具體實驗結論如下。

（1）優(yōu)化后制備工藝如下：大豆磷脂濃度16mg/mL，膽固醇濃度12 mg/mL，三油酸甘油酯濃度12 mg/mL，L-Lys 濃度40 mmol/L，油相/內水相體積比1∶1，初乳/外水相體積比2∶3。DHAD-MVLs平均包封率為90.13%，包封率高。

（2）鹽酸米托蒽醌多囊脂質體呈圓形或卵形，平均粒徑為58.75 μm，粒徑跨距為1.10，Zeta 電 位為-47.1 mV，相轉變溫度為38.8 ℃。制備的鹽酸米托蒽醌多囊脂質體屬于穩(wěn)定體系，與空白脂質體比較，DHAD 的加入對脂質體的性能基本沒有 影響。

（3）脂質體懸液放于37 ℃與4 ℃，168 h 的滲漏率分別為55.9%和23.68%，脂質體懸液于4 ℃保存時較穩(wěn)定。

（4）膽固醇用量過高（20 mg/mL）或過低（4 mg/mL）都會導致鹽酸米托蒽醌加速從脂質體中釋放，而降低三油酸甘油酯的用量則有利于進一步提高多囊脂質體的緩釋效果。

（5）釋放過程中，脂質體0.5 h 內的藥物釋放量均遠低于40%，沒有突釋現象；120 h 后，藥物釋放較完全，藥物累計釋放量大于80%，兩組特征值均符合《藥典》規(guī)定。

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