常 蕾， 胡雪虹， 楊郁文， 陳天子， 鄧惠清， 姜利農(nóng)， 劉正鑾， 張保龍，王榮富

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥230061;3.江蘇省太倉市棉花育種中心，江蘇 太倉 215411)

煙粉虱(Bemisia tabaci)屬半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)小粉虱屬(Stenorrhyncha)，是一個正在快速進化的復合種［1-4］，主要危害茄科、葫蘆科、豆科、菊科、十字花科、錦葵科等植物，其危害包括直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理混亂、分泌蜜露誘發(fā)真菌病害給作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失［5-7］。近年來，Q型煙粉虱逐漸取代 B型煙粉虱成為危害中國農(nóng)區(qū)的主要煙粉虱生物型［8-9］。mtDNA CO I基因序列檢測表明，江蘇地區(qū)煙粉虱種群生物型為Q型和B型，其中Q型煙粉虱占所測總樣本的94.40%［10］。據(jù)報道Q型煙粉虱比B型煙粉虱具有更強的傳毒能力且對許多化學農(nóng)藥產(chǎn)生更強的抗藥性［11-13］。

現(xiàn)在防治煙粉虱的常規(guī)藥劑主要包括有機磷類(辛硫磷、毒死蜱等)、氨基甲酸酯類(滅多威、丁硫克百威等)、新煙堿類(吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺等)以及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑(噻嗪酮、蚊蠅醚)等殺蟲劑［14-15］。對不同類型的殺蟲劑，煙粉虱有著不同的抗藥性分子機制，Nauen等的研究表明，Q型煙粉虱對煙堿類殺蟲劑的抗藥性與微粒體細胞色素P450多功能氧化酶有關［16］。吡蟲啉是世界上使用面積最為廣泛的氯化煙堿類殺蟲劑，但隨著煙堿類殺蟲劑的推廣應用，煙粉虱對它的抗藥水平也在上升［17-19］。張善明等研究發(fā)現(xiàn)在抗有機磷的昆蟲體內(nèi)，羧酸酯酶、多功能氧化酶的活力增加，尤其是羧酸酯酶同工酶分析顯示有高活性的酶帶出現(xiàn)［20］。Alon等［21］研究發(fā)現(xiàn)用有機磷處理具有抗藥性的B型煙粉虱成蟲，其體內(nèi)Coe1基因表達量升高到處理前的4倍。

2009年，Bautista等給小菜蛾幼蟲喂食細胞色素P450酶基因CYP6BG1 dsRNA 1 d后，處理組幼蟲體內(nèi) CYP6BG1比對照組降低了97.7%～98.5%，對達氯菊酯殺蟲劑的抗性下降了48.5% ～61.4%［22］。Mao等將基于棉鈴蟲中腸高度表達的CYP6AE14基因設計的dsRNAs轉入三生煙和擬南芥中，用轉基因植物葉片喂食棉鈴蟲幼蟲后發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲CYP6AE14轉錄水平明顯下降，并且棉鈴蟲對棉酚的敏感性增強［23］。Small等研究發(fā)現(xiàn)稻褐飛虱(Nilaparvata lungens)對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的原因與羧酸酯酶的活性升高有關，且在抗性品系Sritankan中分離出編碼羧酸酯酶的cDNA N1-EST1［24］。以上研究結果表明，昆蟲P450酶系和羧酸酯酶參與殺蟲劑的代謝作用，導致大多數(shù)昆蟲產(chǎn)生抗藥性，通過RNAi沉默昆蟲P450基因和羧酸酯酶基因可有效提高使用殺蟲劑的防治效果。

本研究擬用Q型煙粉虱細胞色素P450基因CYP6CM1和羧酸酯酶基因Coe1構建RNAi載體轉化煙草，研究取食轉基因煙草的煙粉虱對煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉和有機磷殺蟲劑辛硫磷的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗煙粉虱采集自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院溫室內(nèi)的棉花植株，通過mtDNA CO I基因序列鑒定屬Q(mào)生物型［25-26］。含有FAD2內(nèi)含子的載體Hurricane由澳大利亞CSIRO Plant Industry柳青惠贈。普通煙草(Nicotiana benthamiana)、植物表達載體pBI121和農(nóng)桿菌LBA4404由本實驗室保存。

限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司;T4連接酶、Taq DNA聚合酶、RNA提取試劑盒和M-MLV反轉錄酶購自大連寶生物公司;頭孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、DNA凝膠回收試劑盒和大腸桿菌JM109購自上海生工生物工程有限公司;pGEM-T Easy載體購自Promega公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉(0.1%+1.7%)可濕性粉劑(江蘇省蘇科農(nóng)化有限責任公司產(chǎn)品)，用無菌水稀釋至1 g/L;辛硫磷40%乳油(連云港立本農(nóng)藥化工有限公司產(chǎn)品)，用無菌水稀釋1 000倍。防治煙粉虱的藥劑采用生產(chǎn)廠家推薦濃度。

1.2 CYP6CM1和Coe1為靶基因的RNAi載體構建

以TaKaRa RNAiso Reagent(TaKaRa公司)提取煙粉虱 RNA，用 TaKaRa M-MLV reverse transcriptase(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈，用引物F1/R1和F2/R2(表1)分別擴增 CYP6CM1基因和Coe1基因，制備dsRNA植物表達載體的正義鏈和反義鏈。PCR反應條件:94℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，35個循環(huán);72℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用Axygen DNA gel extraction kit(Axygen公司產(chǎn)品)回收純化目的片段混合物作為模板，用引物F1和R2進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物(916 bp)凝膠回收純化獲得嵌合基因。將純化的嵌合基因與pGEM-T easy vector(Promega公司產(chǎn)品)連接，并用熱激法將克隆載體導入大腸桿菌JM109(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒F1/R2-T(Axygen公司產(chǎn)品)。

表1 本研究PCR所用引物Table 1 PCR primers used in this study

利用BamHⅠ-F3/HindⅢ-R3擴增F1/R2-T質(zhì)粒并回收純化PCR產(chǎn)物，用BamHⅠ和HindⅢ酶切PCR產(chǎn)物和中間載體Hurricane，將所獲質(zhì)粒命名為Hurricane-T。

利用SacⅠ-F4/XhoⅠ-R4 PCR擴增F1/R2-T載體質(zhì)粒，回收純化PCR產(chǎn)物(919 bp)，以XhoⅠ和SacⅠ酶切PCR產(chǎn)物和Hurricane-T，酶切產(chǎn)物用T4-DNA酶連接并轉化，所獲陽性克隆命名為Hurricane-RNAi。

用BamHⅠ和SacⅠ酶切植物表達載體pBI121(Clontech 公司產(chǎn)品)和 Hurricane-RNAi，酶切產(chǎn)物用T4-DNA連接酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)連接，所獲陽性克隆經(jīng)雙酶切驗證是否獲得植物表達的RNAi載體。

1.3 農(nóng)桿菌介導轉化煙草

采用凍融法將RNAi植物表達載體導入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中，取健康煙草葉片置于大培養(yǎng)皿，依次經(jīng)75%乙醇浸泡滅菌1 min，0.1%升汞浸泡滅菌8 min，滅菌水沖洗5次并以滅菌濾紙吸去煙葉表面水后，用刀片切成0.5 cm×0.5 cm小塊。用預先培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤5 min，滅菌吸水紙吸干表面菌液后轉移到共培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+3%蔗糖+2.5 g/L植物凝膠，pH 5.8)，21℃暗培養(yǎng)2 d，將葉盤轉移到選擇培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基 +0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+3%蔗糖+2.5 g/L植物凝膠+500 mg/L頭孢霉素 +100 mg/L卡那霉素，pH 5.8)，28～30℃、16 h光照/8 h黑暗下培養(yǎng)，每15 d更換1次選擇培養(yǎng)基。小苗分化后，將其轉移到生根培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+250 mg/L頭孢霉素)。生根后將卡那霉素抗性苗移栽到土壤。

1.4 轉基因煙草PCR檢測

利用CTAB法提取再生煙草植株葉片DNA，用特異引物Carb-Mono-409F/FAD-intron 96R進行PCR檢測RNAi載體中的內(nèi)含子部分序列，目的片段大小為600 bp左右，以非轉基因煙草為對照。PCR擴增程序如下:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，30 個循環(huán);72℃延伸5 min。

1.5 飼喂轉基因煙草對煙粉虱抗藥性效果檢測

1.5.1 飼喂轉基因煙草的煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1和Coe1表達水平檢測 將2個T1代轉基因煙草株系和1個非轉基因普通煙草株系獨立置于3個隔離防蟲箱內(nèi)，每防蟲箱各含10株煙草，并釋放煙粉虱成蟲取食，5 d后各收集煙粉虱30頭，以RNA提取試劑盒(PROMAGE公司產(chǎn)品)提取煙粉虱RNA，用反轉錄酶(大連寶生物公司產(chǎn)品)反轉錄合成cDNA第一鏈，熒光定量PCR檢測煙粉虱CYP6CM1基因(引物F5/R5)和Coe1基因(引物F6/R6)表達水平，以煙粉虱actin基因(引物Bemi-ActinQF和BemiActinQR)為內(nèi)參。熒光定量PCR儀為 qTOWER 2.0/2.2(德國 Analytik jena公司產(chǎn)品)，PCR反應程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán);72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.5.2 飼喂轉基因煙草的煙粉虱對殺蟲劑的敏感性檢測

1.5.2.1 瓊脂保濕浸葉法 按照何鑫等［27］的方法制備瓊脂培養(yǎng)基，摘取防蟲網(wǎng)箱中轉雙基因煙草株系H1、H2和野生型普通煙草葉片，以打孔器打成直徑38 mm的葉盤，置于1 g/L阿維·吡蟲啉和稀釋1 000倍辛硫磷藥液中浸漬20 s，室內(nèi)陰干后，將煙草葉盤正面向下平放于凝固的瓊脂培養(yǎng)基表面，捕捉防蟲箱中取食煙草5 d的煙粉虱成蟲30頭作為試蟲，釋放至煙草葉盤上，任其爬行，接觸一定時間后，記錄試蟲活體總數(shù)，然后將存活試蟲置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25～28℃、14 h光照/10 h 黑暗、濕度 60% ～80%)，24 h、48 h和72 h后分別統(tǒng)計試蟲存活數(shù)。試驗重復3次，每重復含3個葉盤，以無菌水浸漬煙草葉盤處理為空白對照，計算煙粉虱校正死亡率，方法如下:煙粉虱處理組死亡率=(處理組試蟲活體總數(shù)－處理組試蟲存活數(shù))∕處理組試蟲活體總數(shù)×100%;煙粉虱空白對照死亡率=(空白對照試蟲活體總數(shù)－空白對照試蟲存活數(shù))∕空白對照試蟲活體總數(shù)×100%;煙粉虱校正死亡率=(處理組死亡率－空白對照死亡率)/(1－對照組死亡率)×100%。

1.5.2.2 單株活體法 轉雙基因煙草株系H1、H2和野生型普通煙草各取3～5株，每株單獨罩防蟲薄膜，每株接入150只煙粉虱進行取食，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(溫度20～25℃，14 h光照/10 h黑暗)。煙粉虱取食5 d后，分別用1 g/L阿維·吡蟲啉和稀釋1 000倍的辛硫磷噴施單株煙草，藥劑處理24 h、48 h和72 h后統(tǒng)計煙草葉片上的煙粉虱活蟲數(shù)。試驗重復3次，以無菌水噴施煙草植株處理為空白對照，計算煙粉虱校正死亡率，方法如1.5.2.1所述。

2 結果

2.1 RNAi載體的構建

利用引物BamHⅠ-F3/HindⅢ-R3和SacⅠ-F4/XhoⅠ-R4分別擴增獲取Q型煙粉虱CYP6CM1-Coe1基因序列，酶切后先后正反向連接到Hurricane載體FAD2內(nèi)含子兩側，構建了含CYP6CM1-Coe1基因反向重復序列的 Hurricane-RNAi載體，用BamHⅠ和SacⅠ酶切該反向重復序列，連接到同樣經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ酶切的pBI121植物表達載體，獲得了35S啟動子驅動表達的RNAi載體(圖1、圖2)。

圖1 Coe1和CYP6CM1嵌合的dsRNA發(fā)夾結構示意圖Fig.1 The schematic map of chimeric dsRNA hairpin structure of Coe1 and CYP6CM1

圖2 RNAi載體BamHⅠ/SacⅠ雙酶切驗證Fig.2 The RNAi vector confirmed by BamH Ⅰ/Sac Ⅰ double digestion

2.2 轉基因煙草T0代PCR驗證

葉盤法轉化本氏煙，經(jīng)卡那霉素篩選共得到12株獨立再生苗，CTAB法提取再生煙草植株葉片DNA，用引物Carb-Mono-409F和FAD-intron96R進行PCR，檢測再生苗中的CYP6CM1-Coe1基因部分序列與內(nèi)含子部分序列，獲得5株獨立轉基因煙草(圖3)。

圖3 PCR檢測轉基因煙草中CYP6CM1-Coe1基因和FAD內(nèi)含子間的部分序列片段Fig.3 PCR detection of partial sequence between CYP6CM1-Coe1 gene and FAD intron in transgenic tobacco plants by BamHⅠ/SacⅠdouble digestion

2.3 煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因表達量

播種T1代轉基因煙草，經(jīng)卡那霉素處理后，篩選抗性較好的轉基因株系H1和H2，各取10株轉基因苗，置于獨立防蟲網(wǎng)箱內(nèi)，釋放煙粉虱進食，5 d后各收集煙粉虱30頭，檢測其體內(nèi)CYP6CM1基因和Coe1基因的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)取食轉基因煙草的煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因表達量僅為取食非轉基因煙草的煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因表達量的18% ～24%和17% ～33%(圖4)，說明轉基因煙草的 RNAi表達框架可以降低煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因的表達水平。

圖4 煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因與Coe1基因的相對表達量Fig.4 The relative expressions of CYP6CM1 gene and Coe1 gene in Bemisia tabaci

2.4 煙粉虱喂食轉基因煙草后抗藥性檢測

2.4.1 瓊脂保濕浸葉法 煙粉虱進食煙草5 d后，轉移至含阿維·吡蟲啉和辛硫磷殺蟲劑的煙草葉盤研究煙粉虱對殺蟲劑的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)接觸阿維·吡蟲啉殺蟲劑24 h、48 h和72 h后，取食轉基因煙草H1的煙粉虱死亡率分別是55.86%、81.70%、94.44%，取食轉基因煙草H2的煙粉虱死亡率分別是58.96%、85.35%、96.13%，取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率分別是35.15%、63.57%、79.67%，取食轉基因煙草的煙粉虱死亡率比取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率高14.77%～16.46%。接觸辛硫磷殺蟲劑24h、48h和72h后取食轉基因煙草H1的煙粉虱死亡率分別是46.05%、71.94%、91.82%，取食轉基因煙草H2的煙粉虱死亡率分別是47.87%、74.01%、92.46%，取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率分別是30.54%、53.65%、68.88%，取食轉基因煙草的煙粉虱死亡率比取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率高22.94% ～23.58%。表明CYP6CM1-Coe1 RNAi轉基因煙草增強了煙粉虱對煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉和有機磷殺蟲劑辛硫磷的敏感性。

2.4.2 單株活體法 為進一步研究CYP6CM1-Coe1 RNAi轉基因煙草對煙粉虱抗藥性的影響，直接將煙粉虱釋放在轉基因煙草和非轉基因煙草上取食，5 d后，噴施阿維·吡蟲啉殺蟲劑，24 h、48 h和72 h后，取食轉基因煙草H1的煙粉虱死亡率分別是46.11%、60.65%、88.58%，取食轉基因煙草H2的煙粉虱死亡率分別是48.91%、68.05%、91.08%，取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率分別是31.47%、47.28%、72.57%，取食轉基因煙草的煙粉虱死亡率比取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率高16.01% ～18.51%。5 d后，噴施辛硫磷殺蟲劑，24 h、48 h和72 h后，取食轉基因煙草H1的煙粉虱死亡率分別是42.07%、60.19%、84.65%，取食轉基因煙草H2的煙粉虱死亡率分別是45.95%、63.01%、86.01%，取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率分別是28.31%、42.92%、67.25%，取食轉基因煙草的煙粉虱死亡率比取食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率高17.4%～18.76%。單株活體法與瓊脂保濕浸葉法的鑒定結果一致。

3 討論

抗藥性檢測試驗中，喂食煙粉虱表達CYP6CM1-Coe1 RNAi的轉基因煙草后，煙粉虱體內(nèi)P450基因CYP6CM1和羧酸酯酶基因Coe1表達量顯著下降，噴施阿維·吡蟲啉和辛硫磷藥劑后，煙粉虱死亡率明顯高于喂食非轉基因煙草的煙粉虱死亡率，表明煙粉虱取食表達CYP6CM1-Coe1 RNAi的轉基因煙草，導致體內(nèi)細胞色素P450介導的多功能氧化酶和水解酶解毒功能降低，并且對殺蟲劑敏感性顯著增加，證明通過RNAi沉默煙粉虱P450基因和羧酸酯酶基因是有效防治煙粉虱的途徑。但煙粉虱抗藥性的產(chǎn)生是多種因素綜合作用的結果，本研究只是就抗藥性與其體內(nèi)解毒酶作用的關系做了相關性研究，其他如分子水平基因突變、不同環(huán)境下藥劑選擇壓力差異和生物型也會影響煙粉虱對藥劑的敏感性程度［28］。

煙粉虱(Bemisia tabaci)作為世界性多寄主害蟲，具有繁殖能力強、世代重疊嚴重、傳播病毒能力強、生物型種類多和抗藥性強的特點，防治困難［29］。Pan等研究發(fā)現(xiàn)來自14個省的43個種群檢測為Q型，其他來自8個省的12個種群檢測為B型，近年來，Q型煙粉虱逐漸取代B型煙粉虱呈現(xiàn)由南向北不斷擴散的趨勢［30］。江蘇省內(nèi)以Q型煙粉虱為主，其傳毒能力和農(nóng)藥抗性方面強于B型煙粉虱［31］。長期連續(xù)單一使用農(nóng)藥導致其抗藥性不斷上升，可是新型農(nóng)藥的開發(fā)成本越來越高，開發(fā)速度也低于老品種的淘汰速度，所以延長現(xiàn)有農(nóng)藥品種的使用壽命，有助于降低防治煙粉虱的成本。RNA干擾敲除昆蟲抗藥性相關基因是分子生物學領域中功能基因及基因組研究的一種強有力工具。本研究通過構建CYP6CM1-Coe1-RNAi載體，利用喂食法沉默煙粉虱體內(nèi)相關解毒酶基因，實現(xiàn)抗蟲效果的明顯提升，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有指導意義，RNAi技術能夠特異性地抑制昆蟲防御基因的表達，在轉基因抗蟲植物的開發(fā)和害蟲控制中的應用前景非常廣闊［32-33］。

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