趙 晶，張宏坤，馬丹雅，* ，張 嵐，徐 迪

(1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)或非酶褐變反應(yīng)(non-enzymatic browning reaction)是食品中的氨基化合物(胺，氨基酸，肽和蛋白質(zhì))和羰基化合物(糖類)在食品加工和貯藏過(guò)程中發(fā)生的反應(yīng)，由法國(guó)著名科學(xué)家L.C.Maillard 于1912 年發(fā)現(xiàn)的，因反應(yīng)最終生成棕色物質(zhì)，故又稱為“褐變”反應(yīng)。這一反應(yīng)普遍存在于食品加工和貯存過(guò)程中，是加工食品(如焙烤類食品)的色澤和濃郁芳香風(fēng)味的主要來(lái)源，因此在食品加工生產(chǎn)上有著比較廣泛的應(yīng)用，尤其是合成食用香精，主要是利用美拉德反應(yīng)制備［1］。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物除了能提供給食品特殊的氣味外，還具有抗氧化、抗誘變、抗病毒等特性［2-3］，尤其是抗氧化活性，具有取代傳統(tǒng)合成抗氧化劑的潛力，這是因?yàn)槊览路磻?yīng)產(chǎn)物是食品加工和貯藏過(guò)程中自身形成的一類物質(zhì)，可以認(rèn)為是天然的。本實(shí)驗(yàn)采用葡萄糖與賴氨酸在一定條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基的清除率和超氧陰離子O2-·清除率來(lái)判斷美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力，進(jìn)而為新型抗氧化劑的研究與開(kāi)發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-賴氨酸(分析純) 鄭州鴻祥化工有限公司;葡萄糖(分析純) 山東西王生化有限公司;鄰苯三酚(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、三氯化鐵(分析純)、鐵氰化鉀(分析純)、水楊酸(分析純) 天津科密歐;DPPH 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

S54 型紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;DKS-11 型電熱恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL-40B 臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠;98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

1.2.1.1 不同反應(yīng)時(shí)間下制備MRPs 稱取L-賴氨酸1.000g(L-賴氨酸中氨基的物質(zhì)量為0.0137mol)于平底燒瓶中，并加入150mL 蒸餾水使之完全溶解，而后加入葡萄糖4.922g(即葡萄糖中羰基的物質(zhì)量為0.0273mol)，使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1∶2，溶解后用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH8，在100℃下回流反應(yīng)。并在0.5、1、2、4、6、8、10h 取樣，得到不同反應(yīng)時(shí)間下的MRPs，放入4℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

1.2.1.2 不同起始pH 下制備MRPs 使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2。用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)溶液的pH 分別6、7、8、9，在100℃下回流8h 取樣。

1.2.1.3 不同反應(yīng)溫度下制備MRPs 使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2，調(diào)節(jié)pH9，在不同溫度下(70、80、90、100℃)回流8h 取樣。1.2.1.4 不同反應(yīng)濃度下制備MRPs 稱取L-賴氨酸1.000g 4 份(L - 賴氨酸中氨基的物質(zhì)量為0.0137mol)于平底燒瓶中，并加入150mL 蒸餾水使之完全溶解，而后分別加入葡萄糖4.922、2.461、1.231、0.822g，即葡萄糖中羰基的物質(zhì)量分別為0.0273、0.0137、0.0068、0.0046mol，使L-賴氨酸的氨基與葡萄糖的羰基的物質(zhì)量之比為1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3∶1。用0.2mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH 分別為9，在溫度100℃條件下回流反應(yīng)8h 后取樣。

1.2.2 對(duì)O2-·清除率的測(cè)定 將4.50mL 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)、MRPs 樣液1mL 和蒸餾水2.4mL 混勻，25℃下保溫10min 后加入0.1mL 6mmol/L鄰苯三酚，計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)3min 后，加入10mol/HCl 溶液0.1mL，終止反應(yīng)，以蒸餾水為參比，在325nm 下測(cè)定吸光值A(chǔ)。清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

式中:A0為用水代替樣液時(shí)測(cè)得的吸光度;Ai為不同樣液測(cè)得的吸光度。

1.2.3 對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定 取MRPs 樣液2.5mL及2 ×10-2mol/L 的DPPH 溶液2.5mL 加入同一具塞試管中搖勻，于室溫下密閉靜置30min，用無(wú)水乙醇與水混合液(體積比為1∶1)作參比，于517nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［4］，清除率越大抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/A0］×100

式中:A0為未加MRPs 時(shí)DPPH 溶液的吸光度;Ai為加MRPs 后DPPH 溶液的吸光度;Aj為MRPs 的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

超氧陰離子有一定的毒副作用，由多種生物反應(yīng)和光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，它還能分解形成更強(qiáng)的活性氧化物質(zhì)，如單線態(tài)氧和羥自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放超氧陰離子，生成有色的產(chǎn)物。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，可清除超氧陰離子，阻止有色產(chǎn)物的積累［5］。

DPPH 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3 個(gè)苯環(huán)，氮原子上有1 個(gè)孤對(duì)電子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm 附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子由于被配對(duì)，DPPH·濃度減小而使其顏色變淺，在517nm 波長(zhǎng)處的吸光度變小，這種顏色變淺的程度與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析［6］。

由圖1 結(jié)果可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs對(duì)O2-·清除率在6h 前是顯著增強(qiáng)的，從6h 以后MRPs 對(duì)O2-·清除率有個(gè)緩慢下降的趨勢(shì)，MRPs 對(duì)O2-·清除率可能與其分子中的活性羥基和氨基有關(guān)［7］。在6h 前MRPs 分子中活性的羥基和氨基是逐漸增多的，通過(guò)6h 反應(yīng)體系中的氨基與羰基進(jìn)行大量縮合使體系中活性氨基明顯減少，因此對(duì)O2-·清除率也就下降了。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.1 Effect of reaction time on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

同時(shí)從圖1還可知，MRPs 對(duì)DPPH·的清除率是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而越來(lái)越強(qiáng)的，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到8h 時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH·清除率達(dá)到最高。因美拉德反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間，美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物與氨基化合物進(jìn)行醛基-氨基反應(yīng)最終生成類黑精，其短肽含有抗氧化活性的支鏈氨基酸，而且在產(chǎn)生類黑精的同時(shí)，有一系列的美拉德反應(yīng)中間體-還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性［8］。

綜合MRPs 對(duì)兩種清除率反應(yīng)時(shí)間的考慮，MRPs 對(duì)O2-·清除率在6h 達(dá)到最大，但在8h 稍微有所下降，而MRPs 對(duì)DPPH·的清除率在反應(yīng)8h 已經(jīng)達(dá)到最大，所以可以認(rèn)為反應(yīng)8h 為較佳條件。

2.2 反應(yīng)pH 的影響

樣品在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)是無(wú)色的，一經(jīng)加熱后，均有從白色到淺黃色、黃色、橘色最后為褐色的不同程度的顏色漸變過(guò)程。樣品色澤的變化速率隨樣品初始pH 的增加而增加。從圖2 可知隨著反應(yīng)初始pH 的增大，MRPs 對(duì)O2-·及DPPH·的清除率是逐漸增大的，即抗氧化的能力也是逐漸增強(qiáng)的。在pH6～7 偏酸性的環(huán)境中，無(wú)論是O2-·還是DPPH·的清除率增加得都比較平緩。而當(dāng)pH7～8 偏堿性時(shí)清除率曲線的斜率很大，說(shuō)明清除率增加的幅度很快，主要原因是因?yàn)榘被谳^低pH 環(huán)境中質(zhì)子化，不能進(jìn)行親核進(jìn)攻，只有不帶電的氨基能夠與羰基縮合。所以，酸性環(huán)境中羰氨縮合速率很低。羰氨縮合后，糖通過(guò)反醇醛、烯醇化和脫水反應(yīng)進(jìn)行降解，這些反應(yīng)都是具有堿催化作用的［9］，所以美拉德反應(yīng)速率隨介質(zhì)pH 的升高而增大。本實(shí)驗(yàn)選擇賴氨酸與葡萄糖為實(shí)驗(yàn)材料，賴氨酸本身就是一種堿性氨基酸是有利于美拉德反應(yīng)的，從圖2 也可以看出pH8～9 時(shí)MRPs對(duì)O2-·及DPPH·的清除率是平緩增加的，所以選擇初始pH9 的反應(yīng)條件是比較合理的。

圖2 pH 對(duì)MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.2 Effect of pH on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

2.3 反應(yīng)溫度的影響

美拉德反應(yīng)是十分復(fù)雜的化學(xué)過(guò)程，反應(yīng)條件對(duì)MRPs 抗氧化能力的影響也越來(lái)越受到關(guān)注。美拉德反應(yīng)中溫度是一個(gè)非常重要的因素，隨著反應(yīng)溫度的升高，美拉德反應(yīng)的速度大為加快。且溫度較高時(shí)，還可產(chǎn)生許多香味物質(zhì)，這對(duì)MRPs 的抗氧化作用是很有幫助的。

由圖3 可見(jiàn)，不同溫度加熱反應(yīng)得到的MRPs 對(duì)O2-·和DPPH·的清除率也不同，清除率隨溫度的升高而增加，即抗氧化能力增強(qiáng)。70℃清除率低，100℃時(shí)清除率明顯增加，說(shuō)明低于100℃時(shí)，反應(yīng)溫度越高，反應(yīng)越劇烈，顏色越深，MRPs 對(duì)O2-·和DPPH·清除率越大，抗氧化能力就越強(qiáng)。因?yàn)闇囟雀哂欣诿览路磻?yīng)，溫度越高在較短時(shí)間內(nèi)就能生成類黑精，還原酮及一系列含N、S 的雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)都具有清除O2-·和DPPH·的能力。因而根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和相關(guān)理論，認(rèn)為反應(yīng)100℃時(shí)MRPs 對(duì)O2-·和DPPH·的清除能力較好。

圖3 溫度對(duì)MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

2.4 反應(yīng)物濃度的影響

葡萄糖和賴氨酸的不同濃度代表反應(yīng)體系中羰基與氨基的比例不同。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的氨基與羰基比例分別是1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，由圖4 可知在氨基與羰基比例為1∶2 時(shí)，MRPs 對(duì)O2-·和DPPH·的清除能力較強(qiáng)，此時(shí)反應(yīng)體系中氨基所占比例較小，原因可能是因?yàn)榘被脑龆嗍狗肿觾?nèi)氨基和羧基會(huì)失水形成內(nèi)酰胺而降低了參與美拉德反應(yīng)的氨基的物質(zhì)量，使褐變速率減緩，那么MRPs 對(duì)O2-·和DPPH·清除能力就變小了，所以在氨基與羰基比為1∶2 時(shí)，為制備具有抗氧化MRPs 較佳條件之一。

圖4 反應(yīng)物濃度對(duì)MRPs 清除O 2-·和DPPH·的影響Fig.4 Effect of reaction concentration on MRPs scavenging ratio O 2-·and DPPH·

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以賴氨酸和葡萄糖三種不同比例發(fā)生美拉德反應(yīng)制備了其MRPs，隨反應(yīng)的進(jìn)行，測(cè)定在不同pH 和溫度條件下的抗氧化能力。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，得出最佳反應(yīng)條件是:溫度100℃，時(shí)間8h，pH9，氨基與羰基比為1∶2 時(shí)，MPRs 對(duì)O-2·清除率和DPPH·清除率可分別達(dá)到82.35%和71.12%，此時(shí)MPRs 的抗氧化能力最強(qiáng)。

在美拉德反應(yīng)體系中，產(chǎn)物的抗氧化能力同時(shí)受多種因素控制，選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件可以提高M(jìn)RPs 的抗氧化能力。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且是食品加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中自身產(chǎn)生的一類物質(zhì)，可以認(rèn)為是天然的，這給尋找和應(yīng)用天然抗氧化劑提供了新的思路。但因?yàn)镸RPs 的具體組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等依然尚未十分清楚，且對(duì)其抗氧化機(jī)理也有待于進(jìn)一步研究，所以作為商業(yè)應(yīng)用的MRPs 抗氧化劑的問(wèn)題還有待進(jìn)一步深入研究。

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