宋 波，侯怡鈴，丁 祥

( 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充637002)

微生物細(xì)胞的電解刺激培養(yǎng)是電化學(xué)與生物工程交叉領(lǐng)域的一個(gè)重要課題，近年來受到研究者日益增長(zhǎng)的關(guān)注。這一技術(shù)利用直流電或交流電在液相或泥漿體系中引發(fā)電極反應(yīng)，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及活性的目的。目前已成功應(yīng)用于酵母發(fā)酵［1］、生物脫氮［2］以及鐵細(xì)菌［3］E.dissolvens［4-5］等微生物的培養(yǎng)過程。如楊金水等［6］研究了弱直流電場(chǎng)條件對(duì)銅綠假單胞菌的影響，表明不同的電流可改變細(xì)胞通透。此外直流電和交流電的電場(chǎng)刺激對(duì)大腸桿菌和phanerochaete chrysosporium 蛋白的表達(dá)和酶活通透性等都有影響［7-8］。但一直以來，微生物的電解刺激技術(shù)多關(guān)注于外加電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)過程的研究，而對(duì)于直流電和交流電產(chǎn)生的不同效應(yīng)沒有進(jìn)行深入的研究。本文將腸細(xì)菌E.dissolvens 的電解刺激培養(yǎng)過程進(jìn)一步拓展至直、交流電條件下，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、活性以及底物代謝等方面變化，并與直流電條件下所取得相關(guān)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比外，也考察了兩種電流條件下電解水產(chǎn)生羥基自由基和過氧化氫等中間產(chǎn)物的能力差異。其結(jié)果有助于增進(jìn)對(duì)于直、交流電解刺激過程的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也是前期所開展直流電解刺激研究的有益補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌 油田污染水樣。通過以菲為唯一碳源進(jìn)行限制性培養(yǎng)后純化獲得。該菌經(jīng)測(cè)試最終鑒定為腸桿菌Enterobacter dissolvens，屬革蘭氏陰性菌。該細(xì)菌也能降解葡萄糖將此菌培養(yǎng)在以葡萄糖為唯一碳源條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基中同時(shí)添加常用無機(jī)鹽類，濃度分別為(g/L 去離子水):葡萄糖15，K2HPO40.8，KH2PO40.2，NH4NO30.8，MgSO40.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CaCl20.032。進(jìn)行電解刺激實(shí)驗(yàn)之前，首先對(duì)E.dissolvens 進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)［9］以獲取具有較高活力的純菌液，具體步驟為:從-25℃低溫冰箱中保存的甘油管中取出0.1mL 種子菌液，接種至盛有150mL 經(jīng)過濾滅菌培養(yǎng)基的三角瓶(500mL 容積)中，于30℃恒溫?fù)u床(150r/min)中培養(yǎng)約10h。葡萄糖 北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純;DNS、TTC、RNO Sigma，分析純;其余試劑均為分析純。

DYY-III 2 直流電電泳儀 北京六一儀器廠;交流電變頻電源 艾諾儀器公司。

1.2 電解刺激實(shí)驗(yàn)裝置

直流及交流電解刺激實(shí)驗(yàn)在如圖1 所示的玻璃電解瓶中進(jìn)行，瓶體為兩層玻璃層，內(nèi)層裝細(xì)菌液，容積為100mL;外層通水以保持恒溫。兩根鉑絲(直徑0.2mm)從頂端插入并沿對(duì)稱方向固定在內(nèi)層的兩側(cè)作為電極。實(shí)驗(yàn)前將3 個(gè)完全一致的電解瓶及其他實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)高壓蒸汽滅菌，然后將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的300mL 菌液平均分為三份，分別轉(zhuǎn)移至各個(gè)電解瓶，1 個(gè)不加電用作參比，另2 個(gè)分別施加直流電和交流電進(jìn)行電解刺激實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)三個(gè)電解瓶?jī)?nèi)分別放置一個(gè)完全相同的磁力轉(zhuǎn)子，并置于一臺(tái)多頭磁力攪拌器上以恒定速率進(jìn)行攪拌，從而保持瓶?jī)?nèi)菌液的均勻混合［4］。

圖1 細(xì)胞電解瓶實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the electrolytic vessel

1.3 電極水解反應(yīng)中間產(chǎn)物分析

電解刺激過程中·OH(羥基自由基)和H2O2(過氧化氫)兩種水解中間產(chǎn)物的檢測(cè)根據(jù)Wabner 等提供的方法修改而來［10］。其原理是利用對(duì)亞硝基二甲基苯胺(RNO)作為捕捉試劑在中性溶液中與·OH 進(jìn)行選擇性反應(yīng)，而使自身所帶黃色逐漸褪去。這一變化可通過測(cè)量溶液在440nm 處的吸光度(OD440)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。H2O2則利用外加Fe2+離子轉(zhuǎn)化為·OH后(Fenton 反應(yīng)［11］)，同樣通過監(jiān)測(cè)溶液的OD440變化進(jìn)行確定。以上實(shí)驗(yàn)的具體操作，分述如下:

1.3.1 ·OH 含量分析 在圖1 所示電解瓶中加入100mL 含有RNO(50μmol/L)的磷酸鹽緩沖液，其K2HPO4與KH2PO4含量與前述細(xì)菌培養(yǎng)基相同。電流通過從頂端沿對(duì)稱方向插入的鉑片電極(陽極，1cm2)和鉑絲電極(陰極)施加。加電后利用蠕動(dòng)泵將溶液從電解瓶中以恒定流速抽出，在經(jīng)過1 臺(tái)配有流動(dòng)池的分光光度計(jì)(Agilent 8453 UV-Visible Spectrophotometer)后回流至電解瓶中。因此不同時(shí)刻測(cè)得OD440值與初始吸光度值進(jìn)行比較，即可計(jì)算出溶液中RNO 的殘余百分比，其變化斜率可反映出溶液中·OH 的產(chǎn)生情況。

1.3.2 H2O2含量分析 實(shí)驗(yàn)操作與·OH 的分析步驟相同，只是磷酸鹽緩沖液中除加入RNO 外，同時(shí)加入了0.1mmol/L 的FeSO4。因此在相同電流條件下比較加入Fe2+離子與不加Fe2+離子所獲得的RNO降解速率，可以判定溶液中是否有額外·OH 生成，進(jìn)而判斷H2O2的產(chǎn)生情況。

1.3.3 細(xì)胞脫氫酶活測(cè)定 采用TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)顯色法進(jìn)行。每隔2h 取樣一次，測(cè)定脫氫酶時(shí)，取20mL 的試管，分別加入1mL TTC 溶液(0.5%)，Tris-鹽酸緩沖液(pH8.4)，葡萄糖溶液(0.1mol/L)和1mL 的樣品液。混勻后放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育3h，然后滴入2 滴濃硫酸以終止反應(yīng)。加入5mL 甲苯萃取酶促反應(yīng)生成的紅色產(chǎn)物TPF(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride formazan)，并以純甲苯為參比于490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定萃取液的吸光度(A490)。

1.3.4 氧化還原電位測(cè)定 采用氧化還原電極(Pt4865-50-S7，Mettler Toledo)測(cè)定。

1.3.5 其他參數(shù)的測(cè)定 在10mA 條件下平行開展了細(xì)胞的交、直流電解刺激培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。監(jiān)測(cè)了細(xì)胞菌濃、殘?zhí)菨舛?、溶液物化性質(zhì)(pH 和氧化還原電位)諸參數(shù)隨時(shí)間的變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞的交、直流電解刺激培養(yǎng)過程研究

為便于比較，以上結(jié)果均顯示于圖2、圖3 中，并分為參比、直流以及交流三組進(jìn)行對(duì)比。

圖2 細(xì)胞菌濃隨電流的變化Fig.2 Time course profiles of the cell growth

圖3 細(xì)胞比脫氫酶活性隨電流的變化Fig.3 Time course profiles of cell dehydrogenase activity

圖2 所示為細(xì)胞菌濃隨時(shí)間的變化。與不加電的參比樣(Control)相比，受直流電作用細(xì)胞的生長(zhǎng)周期明顯提前，約5h 后進(jìn)入平臺(tái)生長(zhǎng)期，10h 后開始逐漸下降。與此形成對(duì)照的是，交流電的施加未導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯變化，只在后期略有增長(zhǎng)。但是值得注意的是在直流電刺激下，細(xì)胞的生長(zhǎng)提前進(jìn)入了衰亡期。細(xì)胞脫氫酶活的變化如圖3 所示:施加直流電和交流電均導(dǎo)致細(xì)胞脫氫酶活升高，但直流電的刺激效果更為明顯。在電刺激12h時(shí)刻，受直流電刺激細(xì)胞的比脫氫酶活(總顯色度(OD490)/細(xì)胞菌濃(OD600))較參比值提高了0.9倍，而交流電條件下這一增幅為0.3 倍。但在12h之后，交、直流電流作用下細(xì)胞的脫氫酶活變化趨勢(shì)體現(xiàn)出顯著的差異，前者停止增長(zhǎng)而逐漸走平，與參比一致;后者則出現(xiàn)急劇下降，與圖2 中所示同時(shí)期菌濃的下降形成對(duì)應(yīng)。圖4 所示為菌液中殘?zhí)菨舛入S時(shí)間的變化，可以看出直流電條件下葡萄糖的降解速度最快，交流電次之，但略強(qiáng)于參比值。這一結(jié)果與細(xì)胞生長(zhǎng)及脫氫酶活的變化規(guī)律相一致，表明細(xì)胞菌濃與活力的提升的確可以加快底物代謝。

圖4 細(xì)胞葡萄糖含量隨電流的變化Fig.4 Time course profiles of residual glucose

2.2 細(xì)胞的交、直流電解刺激對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的影響

細(xì)胞培養(yǎng)過程中也對(duì)菌液的pH 和氧化還原電位(Eh)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，分別如圖5 和圖6 所示。細(xì)胞培養(yǎng)過程中參比菌液的pH 持續(xù)下降，原因估計(jì)為葡萄糖受腸桿菌代謝時(shí)生成的有機(jī)酸所致［1］。與之相比，直流電解條件下pH 下降更為快速，而交流電解條件下菌液pH 未出現(xiàn)明顯差異，表明兩種電流條件下菌液中酸性物質(zhì)的累積濃度具有差異。氧化還原性方面，加電與參比菌液的Eh 值均呈現(xiàn)出先下降后上升的特征，其中參比菌液中Eh 值的下降應(yīng)主要由于菌液中的溶氧限制所致(采用溶氧電極測(cè)得的溶氧值始終為0)，而加電條件下的Eh 值則明顯受到了電極反應(yīng)的影響:受電解菌液的Eh 值在加電后急劇降低，并在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)顯著低于參比菌液。由于前期在同一實(shí)驗(yàn)體系中已經(jīng)利用循環(huán)伏安法鑒別出水解反應(yīng)為主要電極反應(yīng)，且菌液Eh 值的降低主要由陰極生成的氫氣所導(dǎo)致，因此以上結(jié)果表明，交流電解刺激培養(yǎng)與直流電解刺激培養(yǎng)在過程機(jī)理具有相似性，其實(shí)質(zhì)均是利用水解反應(yīng)影響細(xì)胞生長(zhǎng)及活性，但在同等電流強(qiáng)度下，交流電激發(fā)電極反應(yīng)的能力弱于直流電。

圖5 pH 隨時(shí)間的變化Fig.5 Time course profiles of pH

圖6 氧化還原電位隨時(shí)間的變化Fig.6 Time course profiles of redox potential

2.3 交、直流條件下水的電解中間產(chǎn)物分析

電解水反應(yīng)的終產(chǎn)物是氫氣和氧氣。Sanetaka等人研究了直流電條件下的水電解反應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)其中同時(shí)伴隨生成H2O2和·OH 等氧化性中間產(chǎn)物［12］，而這些中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的生理活性具有抑制性作用。但對(duì)于交、直流電解水反應(yīng)之間的潛在差異，目前尚未見文獻(xiàn)明確報(bào)道。為此我們采用同樣利用亞硝基二甲基苯胺(RNO)作為電子捕捉試劑［10］，分別在同電流和同電壓兩種條件下考察了交、直流電解水反應(yīng)過程中鉑電極上H2O2和·OH 的產(chǎn)生情況，結(jié)果如圖7 所示。

由圖7(a)可以看出，在直流電刺激下，即使是1V 的電壓下，隨著刺激時(shí)間的增加，電極產(chǎn)物對(duì)RNO 的降解率逐漸提高。比較兩個(gè)發(fā)生電極反應(yīng)的溶液，在電刺激的前5min，溶液中有無FeSO4沒有明顯的差異，溶液中RNO 的降解率均為5%左右，這說明了溶液中沒有H2O2產(chǎn)生;值得注意的是在電刺激20min 左右，沒有添加FeSO4的溶液的降解率是13%，而添加了FeSO4的降解率是17%左右，這充分說明了在直流電的刺激下，含F(xiàn)eSO4的溶液中產(chǎn)生了H2O2，而H2O2對(duì)細(xì)胞有毒害作用，正是由于過多的H2O2的產(chǎn)生，所以在細(xì)菌生長(zhǎng)的后期，電流下對(duì)細(xì)菌的刺激效應(yīng)表現(xiàn)為殺菌的效應(yīng)。

同時(shí)對(duì)照交流電下的電極反應(yīng)圖7(b)可以發(fā)現(xiàn)，在1V 的電壓刺激下，幾乎沒有電極反應(yīng)發(fā)生，在溶液中添加FeSO4和不添加FeSO4對(duì)RNO 幾乎都沒有明顯的降解率，這說明，在低電壓下，交流電刺激，不足以產(chǎn)生電極反應(yīng)。而當(dāng)電壓強(qiáng)度增加到5V 時(shí)，從圖7(c)可以看出，對(duì)RNO 的降解率隨著刺激時(shí)間的加長(zhǎng)逐漸上升。在20min 時(shí)達(dá)到7%左右的降解率，這充分說明了5V 電壓下溶液發(fā)生了電極反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加FeSO4和不添加FeSO4的溶液對(duì)RNO 的降解率沒有明顯的差異，這一點(diǎn)暗示了交流電刺激下溶液中沒有產(chǎn)生H2O2。

圖7 利用鉑電極進(jìn)行細(xì)胞外加電場(chǎng)電解培養(yǎng)時(shí)的電極反應(yīng)產(chǎn)物分析圖Fig.7 Time course profiles of the analysis of electro analysis direct current

比較整個(gè)外加電場(chǎng)對(duì)細(xì)菌的電刺激情況，可以清楚地認(rèn)識(shí)到直流電和交流電的電極產(chǎn)物是不同的，直流電的電極產(chǎn)物中·OH，O2和H2O2而交流電的產(chǎn)物中僅含有·OH，O2并沒有H2O2，這一點(diǎn)似乎可以解釋直流電和交流電10mA 電流下，對(duì)細(xì)菌Enterobacter dissolvens 生長(zhǎng)和代謝的不同。直流電刺激的后期產(chǎn)生的H2O2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。

3 結(jié)論與展望

在細(xì)菌E.dissolvens 的批式培養(yǎng)過程中，應(yīng)用直流電和交流電均能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及脫氫酶活產(chǎn)生正面刺激作用，且在相同電流強(qiáng)度下直流電的刺激效果顯著強(qiáng)于交流電。對(duì)于平臺(tái)期細(xì)胞，施加直流電亦導(dǎo)致了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活性出現(xiàn)明顯受損和下降，而采用交流電則未體現(xiàn)出這一抑菌作用。對(duì)·OH 和H2O2兩種電解水中間產(chǎn)物的檢測(cè)表明，交流電產(chǎn)生以上抑菌性物質(zhì)的能力遠(yuǎn)低于直流電，這可能是兩種電流對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程的影響出現(xiàn)差異的主要原因。

目前關(guān)于微生物細(xì)胞的電解刺激培養(yǎng)研究大多采用直流電進(jìn)行，對(duì)于交流電應(yīng)用于此過程的可行性和效果尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)本文結(jié)果可以看出，同等強(qiáng)度下交流電與直流電相比，在激發(fā)電極反應(yīng)的效能方面具有劣勢(shì)，但交流電解水過程中由于不生成H2O2等有害中間產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生明顯的損傷作用，對(duì)于具有較長(zhǎng)生長(zhǎng)周期的微生物細(xì)胞培養(yǎng)過程具有一定應(yīng)用潛力。

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