李 萍，秦國正，王國棟，陳靠山,2,*，陳富華

(1.皖南醫(yī)學院藥學系，安徽 蕪湖 241002；2.山東大學生命科學學院，山東 濟南 250100)

擬康氏木霉(Trichiderma seudokoningii)是本課題組從玉米秸稈中篩選分離出的一株真菌。該真菌可產(chǎn)纖維素酶[1-2]，菌絲富含殼聚糖[3]。郝林華等[4]對該菌的液體深層發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并在100L發(fā)酵罐中進行了中試放大實驗。該菌的發(fā)酵產(chǎn)物——擬康氏木霉胞外多糖具有誘導植物系統(tǒng)抗性的作用[5-9]。Huang Taotao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，擬康氏木霉胞外多糖經(jīng)純化后得到的均一多糖EPS可通過線粒體途徑誘導白血病細胞K562凋亡，此外，該多糖也有明顯免疫活性[11]。真菌多糖的提取一般采取水提法[12]，采用單純水提取[13]或者用聯(lián)合超聲波[14-15]、微波[16-17]、酶[18-19]等方法輔助提取。水提法具有多糖溶出率高、有機溶劑使用量少、對多糖活性破壞小的的特點，在時間、溫度、粉碎粒度、提取次數(shù)和料液比的單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，進行正交試驗，考察最佳提取條件，為擬康氏木霉菌菌絲多糖的進一步研究和生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬康氏木霉發(fā)酵產(chǎn)物由本實驗室自制；木瓜蛋白酶 上海華藍化學科技公司；透析袋(union carbide)；石油醚、氯仿、正丁醇、95%乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；N-1001D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化；4K15低速大容量冷凍離心機 美國Sigma公司；冷凍離心濃縮干燥系統(tǒng) 美國Labconco公司；GY601電子天平 上海良品儀器儀表有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 鞏義予華公司；SHZ-3循環(huán)水真空泵 上?？等A公司。

1.3 方法

1.3.1 擬康氏木霉多糖的提取

1.3.1.1 實驗樣品的前處理[20-21]

將擬康氏木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物用8層紗布過濾收集菌絲，用蒸餾水洗滌3次，用紗布擰出水分。加入3倍體積石油醚，60℃回流2次脫脂，每次2h。脫脂后過濾，濾渣揮干溶劑，加入3倍體積90%乙醇，80℃回流2次，每次2h。過濾，濾渣揮干溶劑脫去單糖和小分子物質(zhì)，備用。

1.3.1.2 多糖含量的測定方法(苯酚-硫酸法)[22]

苯酚溶液的配制：5.0g重蒸苯酚，加入100mL蒸餾水溶解，配制成5g/100mL苯酚溶液，置棕色試劑瓶中，放入4℃冰箱保存，備用。

標準曲線的繪制：用移液器準確吸取葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.6、0.8、1.0mL置于25mL的干燥比色管中，依次加蒸餾水，使總體積均為1.0mL。各管再分別加入5g/100mL苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速滴加H2SO45.0mL，充分搖勻，置于沸水浴中保溫10min，冷卻至室溫后靜置15min，在490nm波長處測吸光度A，以吸光度(Y)為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線圖，計算回歸方程。

1.3.1.3 單因素試驗

1)提取時間對菌絲多糖提取率的影響：預處理后干菌絲過20目篩，準確稱取4份樣品，每份2.0g，料液比1：100(g/mL)，分別在沸水浴中回流1、2、3、4h，提取液用苯酚-硫酸法在490nm波長處測定吸光度。2)提取溫度對菌絲多糖提取率的影響：預處理后干菌絲過80目篩，準確稱取4份樣品，每份2.0g，料液比1：100(g/mL)，分別于25、50、75、100℃(沸水)加熱回流1h，提取液用苯酚-硫酸法在490nm波長處測定吸光度。3)粉碎度對菌絲多糖提取率的影響：預處理后干菌絲分別過20、40、80、120目篩，準確稱取4份樣品，每份2.0g，料液比1：100(g/mL)，沸水浴回流1h，提取液用苯酚-硫酸法在490nm波長處測定吸光度。4)提取次數(shù)對菌絲多糖提取率的影響：預處理后干菌絲過80目篩，準確稱取4份樣品，每份2.0g，料液比1：100，沸水浴中分別回流提取1、2、3、4次，每次1h，提取液用苯酚-硫酸法在490nm波長處測定吸光度。5)料液比對菌絲多糖提取率的影響：預處理后干菌絲過80目篩，準確稱取4份樣品，每份2.0g，分別以料液比(g/mL)：1：10、1：20、1：30、1：40、1：50加入水，沸水浴回流提取1h后， 提取液用苯酚-硫酸法在490nm波長處測定吸光度。每組實驗平行進行3次，用平均值作為最后結(jié)果。

1.3.1.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度、粉碎粒度、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，以多糖得率為評價指標，采用L9(34)正交表設(shè)計正交試驗。每組實驗平行進行3次，用平均值作為最后結(jié)果。

隨著社會的發(fā)展，我國的環(huán)保意識不斷增強，很多地區(qū)的林業(yè)建設(shè)慢慢成為重要的生產(chǎn)活動，筆者結(jié)合從業(yè)經(jīng)驗，圍繞生態(tài)林業(yè)建設(shè)中林業(yè)技術(shù)推廣存在的問題，闡述了新時期林業(yè)技術(shù)推廣的有效方式，以期為業(yè)內(nèi)人士提供參考。

1.3.2 擬康氏木霉多糖得率的測定

1.3.2.1 擬康氏木霉多糖的提取與精制

預處理后的干菌絲經(jīng)最佳提取工藝提取后，所得多糖溶液濃縮至原體積的1/3后加入3倍體積的85%乙醇溶液，4℃靜置過夜，離心。沉淀加蒸餾水溶解后，用Sevag法聯(lián)合酶法脫蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑。加蒸餾水溶解，過D101大孔樹脂，透析后凍干，得精制擬康氏木霉菌絲多糖粉末。

1.3.2.2 多糖含量的測定及得率的計算

換算因子的計算：準確稱取干燥至恒質(zhì)量的精制多糖粉末10.0mg，置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。從中精確吸取1mL，用苯酚-硫酸法測490nm波長處吸光度(A)，求出多糖供試液中相當?shù)钠咸烟琴|(zhì)量濃度(ρ)，按式(1)計算得換算因子。

式中：m為精制多糖質(zhì)量mg；ρ為多糖稀釋液葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；D為多糖的稀釋因素。

多糖含量測定：正交試驗結(jié)果以多糖含量表示(%)，多糖得率按式(2)計算。

式中：ρ為多糖稀釋液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為多糖的稀釋因素；f為換算因子；m為實驗樣品的質(zhì)量/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線回歸方程為：Y = 0.004X ＋ 0.0051，r= 0.9963。

2.2 擬康氏木霉多糖提取單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對提取率的影響

圖 1 提取時間對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

粉碎粒度為20目、料液比1：100、沸水浴條件下考察提取時間對提取率的影響。由圖1可知，隨著提取時間的延長，多糖得率呈上升趨勢，可以得出提取時間越長多糖得率越高，4h為最佳提取時間。

2.2.2 溫度對提取率的影響

粉碎粒度80目、料液比1：100、提取時間1h條件下，考察不同溫度對提取率的影響。從圖2可知，多糖得率隨溫度升高而升高。100℃為最佳提取溫度。

圖 2 溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of polysaccharides

2.2.3 粉碎度對提取率的影響

料液比1：100、沸水浴回流提取1h條件下，考察不同粉碎度對提取率的影響。從圖3可知，粉碎粒徑大于80目時，粉碎度增加，多糖得率增加顯著，達到80目進入平臺期，粉碎粒度提高，提取率基本無變化，所以80目和120目均可作為為最佳粉碎粒度。

圖 3 粉碎度對提取率的影響Fig.3 Effect of particle size on the yield of polysaccharides

2.2.4 提取次數(shù)對提取率的影響

圖 4 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.4 Effect of extracting times on the yield of polysaccharides

粉碎粒度80目、料液比1：100、沸水浴，每次1h，考察不同提取次數(shù)對提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著提取次數(shù)的增加，提取率增高，但超過3次后增加不明顯，所以3次為最佳提取次數(shù)。

2.2.5 料液比對提取率的影響

粉碎粒度80目，沸水浴回流提取1h，考察不同料液比對提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。1：30前隨著料液比的增加多糖得率增加，但料液比超過1：30后反而有所下降，所以最佳料液比為1：30。

圖 5 料液比對提取率的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides

2.3 擬康氏木霉多糖提取正交試驗結(jié)果

選取提取時間、溫度、粉碎粒度、提取次數(shù)4個因素進行四因素三水平正交試驗，以擬康氏木霉多糖含量為考察指標，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of orthogonal array design

表2 正交試驗方差分析Table 2 Analysis of variance for the orthogonal array design

由表1分析可得，4個因素對擬康氏木霉多糖提取影響的順序：提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時間＞粉碎粒度。方差分析見表2。B因素(溫度)P＜0.05，有顯著差異。說明在所設(shè)的不同溫度下，其提取效果有顯著性差異。其他因素各水平間的差異不顯著。從正交試驗結(jié)果可以看出，擬康氏木霉多糖提取率最高的提取條件是A1B3C3D3，即提取時間2h、提取溫度100℃、粉碎粒度120目、提取3次，該最佳工藝提取3批[15]，測定擬康氏木霉多糖得率(11.09±0.13)%，3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié) 論

本實驗通過單因素及正交試驗得出擬康氏木霉菌絲多糖的最佳提取工藝為：料液比1：30、提取時間2h、提取溫度(沸水)100℃、提取粒度120目、提取3次。對提取率的影響提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時間＞粉碎粒度。雖然單因素中最佳提取時間為4h，但提取時間的延長意味著能耗的增加，結(jié)合正交試驗結(jié)果，選擇2h為最佳提取時間。

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