王俊麗 ，張要齊 ★,，孫雪峰 ，張新蕾 ，史 柯

（1.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新鄭 451162；2.河南惠通天下動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 450008）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的腸道傳染病，主要表現(xiàn)為仔豬黃白痢和水腫病，隨著集約化養(yǎng)豬方式的日益加大，該病呈上升趨勢(shì)，已成為仔豬死亡的主要原因之一。目前臨床上常用抗生素進(jìn)行治療，雖然具有一定的療效，但往往存在易產(chǎn)生耐藥性及畜產(chǎn)品藥物殘留等問(wèn)題，不僅影響到治療效果而且還危害人類健康[1,2]。中藥以其本身來(lái)源的廣泛性、成本低廉、毒副作用小、且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)在獸醫(yī)臨床受到重視，近年來(lái)，對(duì)于單味中藥對(duì)豬大腸桿菌抑菌活性的研究報(bào)道很多[3-5]，但往往存在有效成分單一、作用不明顯等問(wèn)題，本研究在前續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選了7個(gè)中藥組方，并通過(guò)試管二倍稀釋法和管碟法對(duì)其體外抑菌活性進(jìn)行研究，旨在篩選出抗大腸桿菌的最佳組方，為臨床治療仔豬大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 中藥復(fù)方1：黃連、黃柏、白術(shù)、黨參、赤石脂；復(fù)方2：黃連、黃柏、魚腥草、金銀花、赤石脂；復(fù)方3：黃連、黃柏、白術(shù)、防風(fēng)、赤石脂；復(fù)方4：黃柏、穿心蓮、金銀花、連翹、赤石脂；復(fù)方5：黃連、黃柏、黃芪、白頭翁、赤石脂；復(fù)方 6：黃連、防風(fēng)、白術(shù)、黨參、赤石脂；復(fù)方7：黃連、黃柏、板藍(lán)根、魚腥草、赤石脂。

1.1.2 供試菌株豬大腸桿菌由河南科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，所有菌種置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 供試菌株培養(yǎng)基（1）普通肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、純化水至1000ml，pH值 7.2～7.4；（2）普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，NaCl5g，瓊脂 20g，純化水至1000ml，pH值7.2～7.4。配制后高壓滅菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 藥液的煎制：每個(gè)組方按比例混合，稱取適量裝入三角燒瓶中，加10倍量水浸泡2h，電爐加熱微沸2h，8層紗布過(guò)濾，藥渣再加8倍量水煮沸1h，過(guò)濾后合并2次濾液，離心過(guò)濾、濃縮至終濃度為1g/ml。調(diào)pH7.3，分裝，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備：菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，備用。

1.2.3 18種中藥最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[6]

采用試管二倍稀釋法：（1）取滅菌有棉塞試管11支并編號(hào)，每管先加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2.0ml，于第一管中加入滅菌的受試復(fù)方中藥水提物2.0ml，混勻后取出2.0ml放入第2管中，依次梯度稀釋直到第9管取出2.0m l棄去，第10管不加藥物，作為陽(yáng)性對(duì)照，第11管加受試復(fù)方中藥水提物2.0ml，混勻后取出2.0ml棄去，不加細(xì)菌，作為陰性對(duì)照。各管平行3份。（2）經(jīng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18h的試驗(yàn)菌液用無(wú)菌肉湯稀釋100倍。取細(xì)菌稀釋液0.1ml分別加入上述1～10管中混勻，11號(hào)管加0.1ml滅菌生理鹽水，置各管于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。在陽(yáng)性對(duì)照管細(xì)菌生長(zhǎng)呈混濁狀，而陰性對(duì)照管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)呈透明狀的前提下，觀察其他試管的混濁情況。如試管內(nèi)混濁，說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)；如試管內(nèi)澄清透明，證明無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)而含藥液濃度最低者，即為該種藥物對(duì)該菌株的最低抑菌濃度。

1.2.4 18種中藥最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

取MIC終點(diǎn)濃度以上未生長(zhǎng)細(xì)菌的各稀釋管內(nèi)培養(yǎng)物0.1ml，接種于瓊脂平板培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為受試中藥水提物的最低殺菌濃度。

1.2.5 藥物敏感試驗(yàn)

采用管碟法：將滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放置凝固用作底層培養(yǎng)基。用無(wú)菌吸管吸取大腸桿菌培養(yǎng)液（稀釋為106cfu/ml）0.1m l，滴于底層培養(yǎng)基上，用無(wú)菌棒將菌液涂勻，待表面干燥后，用無(wú)菌鑷子在每個(gè)平皿中等距離放置3個(gè)牛津杯，用滴管分別將藥液加到牛津杯中，以滴滿為度，蓋上平皿蓋。然后將滴加藥液的平皿水平置恒溫箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)18～24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑>20mm為高敏，抑菌圈直徑15～20為中敏，抑菌圈直徑<15mm為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏感[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 試管二倍稀釋法測(cè)定各復(fù)方中藥的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 各復(fù)方中藥的體外最低抑菌濃度和最低殺菌濃度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，復(fù)方1和復(fù)方3對(duì)豬大腸桿菌的抑菌效果較好，MIC值和MBC值均為15.63mg/ml和62.5mg/ml；其次是復(fù)方5和復(fù)方4，復(fù)方 5MIC值和 MBC值為 31.25mg/m l和62.5mg/ml，復(fù)方 4MIC值和 MBC值均為62.5mg/ml。而復(fù)方2、復(fù)方6和復(fù)方7抑菌效果不明顯，MIC值和MBC值相對(duì)較高。

2.2 管碟法測(cè)定各復(fù)方中藥的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2。

由表2可以看出，復(fù)方1和復(fù)方3的平均抑菌圈直徑相對(duì)較大，分別為15.20mm和17.99mm，抑菌強(qiáng)度均為中敏；其他幾個(gè)復(fù)方抑菌強(qiáng)度相對(duì)較低，均為低敏。

表2 各復(fù)方中藥的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中藥復(fù)方研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)之一，也是中醫(yī)辨證論治理論精髓的具體體現(xiàn)，它是在辨證審因決定治法以后，選擇合適的藥物酌定用量，按照組成原則妥善配伍而成的一組藥物，其所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)[7]。本研究在前續(xù)單味中藥體外抑菌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥復(fù)方之特點(diǎn)以及仔豬腹瀉的中獸醫(yī)理論完成組方，整個(gè)處方篩選過(guò)程嚴(yán)格遵循科學(xué)性原則。按中獸醫(yī)辨證理論，大腸桿菌病為濕熱壅積腸道而引起的里熱證，宜清熱解毒、燥濕止痢[8]。早先就有報(bào)道顯示，清熱藥絕大部分具有抑菌作用[9]。部分研究者以清熱解毒、清熱燥濕為藥物篩選方向，尋找專門針對(duì)致病性大腸桿菌的單味中藥與組方[10]。本研究從抗菌消炎、清熱燥濕、瀉火解毒、健脾理氣、勝濕止痛、澀腸止瀉等方面入手，結(jié)合獸醫(yī)臨床實(shí)踐，按照中獸醫(yī)理、法、方、藥的基礎(chǔ)理論進(jìn)行組方，并通過(guò)其對(duì)豬大腸桿菌的體外抑菌活性篩選最佳組方。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方1和復(fù)方3在試管二倍稀釋法和管碟法中均表現(xiàn)較好的抑菌效果，兩個(gè)組方MIC值和MBC值相同，從二者抑菌強(qiáng)度來(lái)看，復(fù)方3比復(fù)方1平均抑菌圈直徑較大，但二者均在中敏抑菌強(qiáng)度范圍之內(nèi)。從二者復(fù)方組份分析，兩個(gè)復(fù)方均含有黃連、黃柏、白術(shù)和赤石脂，整個(gè)復(fù)方僅為防風(fēng)和黨參之間的差異，從二藥藥理功效來(lái)看黨參補(bǔ)中益氣、健脾生津，與白術(shù)是常配藥[11]；防風(fēng)勝濕止痛，止痙定搐，古方中常用防風(fēng)作為痛瀉藥方的引經(jīng)之要藥，其能舒脾瀉肝加之白術(shù)的燥濕健脾，二者相配可以補(bǔ)脾土而瀉肝木，調(diào)氣機(jī)以止痛瀉。鑒于中藥古方之精髓以及良好的體外抑菌效果，本研究確定復(fù)方3為最佳組方。

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