胡 薇 李 沐 李 婷 田玉華 孟星宇 劉 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

鹿茸是梅花鹿的雄性第二性征，每年可周期性的脫落與再生，是哺乳動物中唯一的可再生器官，它的生長發(fā)育受特定的分子機理調(diào)控。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸再生與其它低等生物的斷肢再生不同，是一個依賴于干細胞的過程［1－3］。此外，在哺乳動物中，鹿茸的生長速度也是其他組織器官所無法比擬的，在鹿茸生長最旺盛階段，它以1～2 cm/d的速度快速生長，其頂端增殖區(qū)細胞的增殖速度比腫瘤細胞還快，但與腫瘤不同的是鹿茸的生長受到了很好的調(diào)控，在維持高速生長的同時并未出現(xiàn)任何癌變跡象［4－5］。鹿茸的這些獨特之處使它成為了腫瘤醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它由3個亞單位構(gòu)成，即RNA亞單位(TR)，端粒酶催化亞單位(TERT)和端粒酶蛋白亞單位(TEP1)。端粒酶能以自身RNA為模板，催化合成端粒末端(TTAGGG)n序列，使端粒延長，從而延長細胞的壽命甚至使其永生。利用TRAP法可以檢測到端粒酶在腫瘤細胞及干細胞中的高活性表達，但在正常細胞中卻檢測不到端粒酶活性［6］。目前研究表明，有端粒酶活性的細胞幾乎均存在TERT的表達，但在正常細胞中雖有TR和TEP的表達，卻沒有TERT的表達，這說明端粒酶活性主要由TERT的表達水平的高低決定［7－8］。TERT是端粒酶的主要組成部分，TERT基因mRNA表達水平與端粒酶活性存在良好的相關(guān)性［9－10］。因此，本研究旨在采用 TRAP法檢測鹿茸頂端增殖區(qū)各組織部位的端粒酶活性，以及檢測體外不同培養(yǎng)代數(shù)鹿茸間充質(zhì)干細胞的端粒酶活性。在此基礎(chǔ)上克隆了梅花鹿TERT基因的部分序列，利用相對熒光定量PCR技術(shù)分析TERT基因在鹿茸頂端增殖區(qū)的表達水平，探討鹿茸的再生發(fā)育與端粒酶活性的關(guān)系，期望為深入研究鹿茸生長調(diào)控的分子機理提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮東北梅花鹿鹿茸于2012年6月采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗鹿場1頭4歲左右的健康雄鹿，保存于液氮中帶回實驗室備用。胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、膠原酶I、膠原酶II購自Sigma;胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone;TRIzoL試劑購自Invitrogen 公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA 聚合酶、OligdT、dNTPs、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ和HindIII、DL－2000 Marker購自 TaKaRa公司，Real Master Mix購自長春寶泰克公司。

1.2 鹿茸細胞培養(yǎng)

按照Li等的取材方法［11］，在解剖顯微鏡下定位并分離鹿茸頂端組織茸皮層、間充質(zhì)層和軟骨層。采用酶消化法，將不同部位組織剪成約1 mm的小塊，用膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶37℃消化1.5 h，再加入膠原酶Ⅱ繼續(xù)消化3 h。當(dāng)觀察到大量細胞從組織塊中游離出來時，1 000 r/min離心5 min。將離心收集的細胞與組織塊加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中37℃、5%的CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 鹿茸細胞端粒酶活性檢測

取對數(shù)生長期的茸皮層細胞、間充質(zhì)細胞和軟骨細胞，當(dāng)細胞豐度達到80%時，用胰蛋白酶消化并離心收集細胞，向細胞沉淀加入CHAPS裂解液200 μL(預(yù)先加入PMSF和巰基乙醇)，冰浴裂解30 min。4℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清并分裝。

以小鼠MA782細胞的端粒酶提取液為陽性對照，采用端粒重復(fù)擴增(TRAP)法［12］檢測端粒酶活性，引物序列分別為 5'－TCACCTTGTAATCCGTCGAGCAGAGTT－3'(TF)和 5'－CAACAT CTCCACTACCTTCTAACCGTAACC－3'(TR)。TRAP 反應(yīng)體系為50 μL其組分為10×TRAP緩沖液(200 mmol/L Tris－HCl，pH=8.3，15 mmol/L MgCl2，1%Tween－20(V/V)，630 mmol/L KCl，10 mmol/LEGTA)5.0 μL、dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 50 μmol(采用蠟封的方式將dCTP與總體系分開)，TF引物和反向引物TR各15 pmol，Taq聚合酶2 U，模板2.0 μL，加入無菌 DEPC 處理的水至 50.0 μL。反應(yīng)條件為25℃保溫20 min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶產(chǎn)物，90℃加熱3 min滅活端粒酶(在此期間將石蠟熔化以便dCTP進入總反應(yīng)體系)，PCR擴增(94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán))。通過12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。

1.4 不同培養(yǎng)代數(shù)鹿茸間充質(zhì)干細胞端粒酶活性的檢測

用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)干細胞，當(dāng)細胞豐度達到80%時即可傳代，分別收集1代至5代的鹿茸間充質(zhì)干細胞，提取端粒酶并用TRAP法檢測端粒酶活性。

1.5 鹿茸細胞總RNA提取與雙鏈cDNA的合成

待鹿茸細胞豐度達到80%以上時收集細胞，按照Trizol操作手冊分別提取茸皮層細胞、間充質(zhì)細胞和軟骨細胞樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo－dT為引物，以逆轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。

1.6 梅花鹿TERT基因部分序列的克隆與序列分析

參照GenBank中相關(guān)序列，設(shè)計TERT基因特異性引物(上游引物:GCCAGAGTCGTG CAGAGG和下游引物:CTTTGACGAACCCTTGGT)，以 cDNA為模板進行PCR擴增，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，涂板并于37℃培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送北京三博遠志公司測序。并將測序結(jié)果分別與 GenBank中牛(NM_001046242)和羊(EU139124.1)的序列進行同源性分析。

1.7 相對熒光定量PCR法檢測鹿茸細胞TERT基因的表達水平

合成用于TERT基因的特異引物(上游引物5'－CTGCGCCTACCAGGTGTGT－3'和下游引物 5'－CCGTGGCAGCCTTTCG－3'，擴增片段長度為 96 bp，熒光探針:FAM－CGCCGCTCTACGAC CTCCGCTAMRA。以鹿的持家基因actin(GenBank登錄號:AY345228)作為內(nèi)參基因，合成actin引物(上游引物 5'－TGACCCTTAA GTACCCCATCGA－3'和下游引物5'－TTGTAGAAG GTGTGGTGCCAGAT－3')，擴增片段長度為 85 bp，熒光探針:FAM－CACGGCATCGTCACCA ACTGGGA－TAMRA。

以鹿茸細胞cDNA為模版，PCR分別擴增TERT和 actin。PCR 體系:cDNA 模板 6.00 μL，上下游引物各 1.00 μL，dNTP 2.00 μL，10×Ex Taq buffer 2.50 μL，Ex Tag 0.25 μL，加去離子水至 25 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃30 s，進行40個循環(huán)。采用Real Master Mix試劑和7500 Real Time PCR System分析TERT基因在茸皮層細胞、間充質(zhì)和軟骨細胞中的表達水平。Realtime PCR體系:1ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，上下游引物各 5 pmol，10 μL real Master Mix，總體積為 25 μL。反應(yīng)條件:94℃激活DNA聚合酶3 min;94℃變性30 s;59℃復(fù)性30 s;68℃延伸45 s;進行40個循環(huán)。使用StepOne Software v2.1軟件分析TERT相對內(nèi)參actin基因的差異表達Ct值(Ct為熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸頂端不同組織細胞的端粒酶活性檢測

TRAP法檢測結(jié)果(圖1)顯示，在鹿茸頂端增殖區(qū)茸皮層細胞、間充質(zhì)細胞及軟骨細胞中均檢測到端粒酶活性，與小鼠MA782細胞相比，端粒酶活性在間充質(zhì)細胞、軟骨細胞和茸皮層細胞中依次降低，其中，間充質(zhì)干細胞中端粒酶活性最高。

圖1 鹿茸頂端不同組織細胞的端粒酶活性檢測結(jié)果

2.2 不同培養(yǎng)代數(shù)鹿茸細胞的端粒酶活性檢測

采用TRAP法進行端粒酶活性的測定。與對照組小鼠乳腺癌細胞相比，不同代數(shù)間充質(zhì)干細胞端粒酶活性變化無明顯差異。說明鹿茸再生過程與端粒酶活性呈一定的相關(guān)性，端粒酶可能是研究鹿茸再生機理的一個很重要的方向(圖2)。

圖2 體外培養(yǎng)1代至5代的間充質(zhì)細胞端粒酶活性

2.3 鹿茸頂端組織總RNA的提取

各樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，28S、18S和5S 3條帶清晰可見(圖3)，表明所提取的茸皮層、間充質(zhì)和軟骨組織總RNA質(zhì)量符合定量PCR分析用標(biāo)準(zhǔn)，未發(fā)生RNA明顯降解。

圖3 鹿茸頂端組織RNA提取結(jié)果

2.4 TERT基因部分序列的克隆

TERT基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到約915 bp的1條特異性條帶(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。提取重組質(zhì)粒，用XbaⅠ和HindIII雙酶切質(zhì)粒pMD－18T－TERT(圖5)。從圖4中可看出，可獲得與目的帶大小相符的電泳條帶915 bp，表明克隆成功。

圖4 TERT基因部分序列克隆PCR鑒定結(jié)果

圖5 TERT基因部分序列克隆雙酶切鑒定結(jié)果

2.5 TERT基因的部分cDNA序列分析

梅花鹿TERT基因部分序列與GenBank中牛和羊的核苷酸和氨基酸序列Blast分析結(jié)果顯示:梅花鹿TERT基因編碼區(qū)部分cDNA為915 bp，核苷酸序列與牛、羊的同源性分別為94.89%和94.31%(圖6);氨基酸序列同源性分別為92.16%和92.11%(圖7)。

2.6 TERT基因在鹿茸頂端組織中的表達水平

以鹿茸頂端組織cDNA為模版，PCR分別擴增actin和TERT。actin擴增長度為85 bp，TERT擴增片段長度為105 bp，見圖8。利用Real time PCR的方法，使用梅花鹿actin作為內(nèi)源參照基因，每個樣本做3個重復(fù)，檢測TERT基因在鹿茸組織不同部位的表達豐度。通過RT－PCR和Real time PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)，在鹿茸頂端組織不同部位TERT基因mRNA表達水平存在明顯的表達差異，其中茸皮層細胞、軟骨細胞和間充質(zhì)細胞中TERT基因的表達量呈遞增趨勢(圖8和表1)。

圖6 梅花鹿、牛、羊TERT基因核苷酸序列分析結(jié)果

圖7 梅花鹿、牛、羊TERT基因氨基酸序列分析結(jié)果

圖8 鹿茸頂端組織不同部位TERT基因及actin基因RTPCR結(jié)果

表1 鹿茸組織TERT基因表達豐度檢測結(jié)果(n=3，ˉx±s)

3 結(jié)論與討論

己有大量的證據(jù)顯示，鹿茸的再生建立與來源同特定位置的組細胞有關(guān)，也就是生茸區(qū)骨膜中的干細胞，即鹿茸的再生包含大量間充質(zhì)干細胞的形成。由于鹿茸的獨特性質(zhì)，更深入地了解鹿茸再生對于再生醫(yī)學(xué)的研究十分重要。因此，不斷地深入探索鹿茸再生過程內(nèi)部的調(diào)控機制是目前研究者的共同目標(biāo)。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它以自身RNA為模板合成富含脫氧單核糖鳥苷的端粒DNA序列，從而彌補因有絲分裂而消耗的端粒長度，在延長細胞壽命上起著重要作用。近年來許多學(xué)者對端粒酶的研究結(jié)果表明，端粒酶調(diào)控著細胞增殖活性和細胞壽命，是決定基因擴增和穩(wěn)定的主要因素。端粒酶在大部分正常的體細胞中活性受到明顯的抑制，在大多數(shù)腫瘤細胞及干細胞等增殖旺盛的細胞中則可檢測到高活性的端粒酶，而鹿茸細胞在快速生長期的增殖速度比腫瘤細胞還快。Lee等［13］體外研究表明，端粒酶的過表達能提高胚胎干細胞的增殖、分化能力。Flores等［14］研究小鼠的表皮干細胞，發(fā)現(xiàn)其端粒長度和端粒酶的活性影響著表皮干細胞的增殖、遷移和分化;端粒的縮短可抑制干細胞的動員，從而抑制表皮干細胞的體外增生。頂端增殖區(qū)是梅花鹿鹿茸的生長中心，已有研究顯示，鹿茸的再生是一個基于干細胞的過程，而間充質(zhì)就是鹿茸再生的干細胞儲備層［15］。因此，開展鹿茸細胞端粒酶活性的相關(guān)研究，對于探討鹿茸周期性再生發(fā)育機理是一個重要的新思路。

本研究從鹿茸頂端增殖區(qū)分離培養(yǎng)了茸皮層、間充質(zhì)層和軟骨層細胞，并采用TRAP法檢測其端粒酶活性。結(jié)果顯示，在這4種細胞中均表現(xiàn)出不同程度的端粒酶活性，其中間充質(zhì)層細胞的端粒酶活性明顯高于其他組織層細胞，端粒酶活性在增殖區(qū)的各層中呈現(xiàn)遞減的趨勢，隨著細胞逐漸分化成熟，端粒酶活性逐漸降低。這也支持了間充質(zhì)細胞是鹿茸生長過程中的干細胞來源這一說法。此外，本研究同時利用TRAP法檢測了體外培養(yǎng)不同代數(shù)的間充質(zhì)細胞的端粒酶活性，結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的不同代數(shù)間充質(zhì)細胞端粒酶活性并沒有明顯變化。這一結(jié)果進一步證明，在鹿茸快速生長階段，其頂端生長中心表達了端粒酶，端粒酶在鹿茸的生長發(fā)育中可能具有重要的作用。這與孫浩然等［15］推斷，在生長速度極快的鹿茸中很可能表達端粒酶，以維持高速的增殖分化，端粒酶可能參與調(diào)控鹿茸的生長發(fā)育的結(jié)果基本一致。

在端粒酶組分中，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，TERT基因在調(diào)節(jié)端粒酶活性中起決定作用。TERT是端粒酶發(fā)揮作用的重要限速步驟。本研究初次獲得了梅花鹿TERT基因的部分cDNA序列，并發(fā)現(xiàn)與牛和羊的TERT基因的同源性較高，說明該基因進化程度比較保守。以此設(shè)計探針利用熒光定量PCR技術(shù)檢測鹿茸頂端不同組織部位TERT基因的表達水平。結(jié)果表明，在間充質(zhì)細胞中TERT基因的mRNA表達量最高，其次為軟骨細胞和茸皮層細胞，TERT在增殖區(qū)的各層中的表達量呈現(xiàn)遞減的變化，與端粒酶活性變化模式相一致，這一結(jié)果驗證了TRAP法檢測端粒酶活性結(jié)果的可信性。

目前，鹿茸細胞中端粒酶活性的研究才剛剛起步。Kierdorfu等［16］研究顯示，鹿茸再生是是由于角柄末梢的骨膜干細胞受到激活，從而完成鹿茸的再生。近年來，Li等［17－18］對赤鹿生茸骨膜的發(fā)育進行了大量的研究，認為具有極強的分化能力的骨膜可能是出生后仍保留的胚胎組織。隨著鹿茸的生長，骨膜組織向間充質(zhì)組織轉(zhuǎn)化，而其中的間充質(zhì)細胞仍然具有干細胞的特征，在體內(nèi)可以向軟骨組織轉(zhuǎn)化［19－20］。但是由于鹿種的差別，在梅花鹿中骨膜很薄，要想從骨膜中將細胞層從纖維層中剝離開來很難，因此，選擇分離仍然具有干細胞特征的間充質(zhì)干細胞為主要研究對象，分析鹿茸間充質(zhì)干細胞端粒酶活性和TERT基因的表達水平。由此，推測鹿茸干細胞的永生化能力和端粒酶活性的相關(guān)性，以及端粒酶在鹿茸的生長規(guī)律和再生調(diào)節(jié)機制等方面可能具有的重大意義，這些問題國內(nèi)外研究甚少，研究結(jié)果說明，在鹿茸的快速生長期，其頂端增殖區(qū)的各層組織中均表達了不同活性的端粒酶，并且端粒酶活性與細胞的分化狀態(tài)有關(guān)，細胞分化程度越低端粒酶活性越高，說明端粒酶可能參與調(diào)控鹿茸細胞的增殖與分化，可能是鹿茸快速生長的原因之一，這也給人們帶來了許多新的思考，筆者將通過課題的不斷深入開展和探索，為鹿茸再生機理的闡明提出一些新的觀點。

［1］ Price J，Allen S.Exploring the mechanisms regulating regeneration of deer antlers［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2004，359:809－822.

［2］ Suttie J M，Gluckman P D，Butler J H，et al.Insulin-like growth factor 1(igf-1)antler stimulating hormone［J］.Endocrinology，1985，116(2):846－848.

［3］ Suttie J M，Gluckman P D，F(xiàn)ennessy P F，et al.Elevated plasma igf1 levels in stags prevented from growing antlers［J］.Endocrinology，1988，122(6):3005－3007.

［4］ Suttie J M，White R G，Breier B H，et al.Photoperiod associated changes in insulin-like growth factor-i in reindeer［J］.Endocrinology，1991，129(2):679－682.

［5］ Price J，F(xiàn)aucheux C，Allen S.Deer antlers as a model of mammalian regeneration［J］.Curr Top Dev Biol，2005，67:1－48.

［6］ 朱曉應(yīng)，符偉軍，洪寶發(fā).端粒酶與腫瘤靶向治療［J］.國外醫(yī)學(xué)遺傳分冊，2005，28(6):366－368，353.

［7］ Counter C M，Meyerson M，Eaton E N，et al.Telomerase activity is restored in human cells by ectopic expression of hTERT(hESTZ)，the catalytic subunit of telomerase［J］.Oncogene，1998，16(9):1217－1222.

［8］ Ramakrishnan S，Eppenberger U，Mueller H，et al.Expression profile of the putative catalytic subunit of the telomerase gene［J］.Cancer Res，1998，58(4):622－625.

［9］ Lehner R，Enomoto T，McGregor J A，et al.Quantitative analysis of telomerase hTERT mRNA and telomerase activity in endometrioid adenocarcinoma and in normal endometrium［J］.Gynecol Oncol，2002，84(1):120－125.

［10］ 田玉華.梅花鹿角脫盤蛋白多肽的分離純化及活性研究［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［11］ Li C，Waldrup K A，Corson I D，et al.Histogenesion of antlerogenic tissues cultivated in diffusion chambersin vivo in red deer(Cervus elaphus)［J］.J Exp Zool，1995，272(5):345－355.

［12］ 吳東林.端粒重復(fù)擴增程序(TRAP)的改進和應(yīng)用以及端粒酶酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.長春:中國人民解放軍軍需大學(xué)，2001.

［13］ Lee M K，Hande M P，Sabapathy K.Ectopic mTERT expression in mouse embryonic stem cells does not affect differentiation but confers resistance to differentiation-and stress-induced p53-dependent apoptosis［J］.J Cell Sci，2005，118:819－829.

［14］ Flores I，Cayuela M L，Blasco M A.Effects of telomerase and telomere length on epidermal stem cell behavior［J］.Science，2005，309:1253－1256.

［15］ 孫浩然，鄭偉，吳山力，等.梅花鹿鹿茸細胞端粒酶活性及其mRNA表達的檢測［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(2):1073－1075.

［16］ Kierdorfu U，Kierdorf H，Szuwart T.Deer antler regeneration:cells，concepts，and controversies［J］.Morphol 2007，268(8):726－38.

［17］ Li C，Suttie J M.Deer antlerogenic periosteum:a piece of postnatally retained embryonic tissue［J］.Anat Embryol，2001，204(5):375－388.

［18］ Li C，Harris A J，Suttie J M.Tissue interactions and antlerogenesis:new findings revealed by a xenograft approach［J］.J Exp Zool，2001，290(1):18－30.

［19］ Gyurján I Jr，Molnár A，Borsy A，et al.Gene expression dynamics in deer antler:mesenchymal differentiation toward chondrogenesis［J］.Mol Genet Genomics，2007，277(3):221－235.

［20］ Mount J G，Muzylak M，Allen S，et al.Evidence that the canonical Wnt signalling pathway regulates deer antler regeneration［J］.Dev Dyn，2006，235(5):1390－1399.