馬微微 王 軍 穆立薔

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040) (中國農(nóng)業(yè)大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué))

紫椴(Tilia amurensis Rupr.)為椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬落葉闊葉喬木［1］，其花具有清熱解表之功效，對(duì)感冒、發(fā)熱，腎盂腎炎，口腔炎和喉炎等具有良好的治療作用［2］，在我國民間被廣泛使用。椴樹屬植物花中主要含有揮發(fā)油、黃酮、甾醇、脂肪酸、萜烯、香豆素等化合物，并有多種黃酮類單體化合物已被成功分離［3］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，歐洲產(chǎn)椴樹具有治療神經(jīng)紊亂、失眠、頭痛、感冒、發(fā)燒、支氣管炎、流感、風(fēng)濕等癥的功效［4－9］。本研究對(duì)紫椴花及其分離各組分的抗菌活性進(jìn)行了研究，以期為紫椴花抗菌藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

材料與儀器:紫椴花于2008年6月至7月采于東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)和黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)穆立薔教授鑒定為椴樹科椴樹屬植物紫椴的花。革蘭氏陽性菌有表皮葡萄球菌(Se，Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Sa，Staphylococcus aureus)、檸檬色葡萄球菌(Sc，Staphylococcus citreus);革蘭氏陰性菌有大腸桿菌(Ec，Escherichia coli)、變形桿菌(Pv，Proteus vulgaris);真菌有白色念珠菌(Ca，Candida albicans)。供試菌種均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;化學(xué)試劑均為分析純。

提取物的制備:取干燥的紫椴花500 g，加8倍量的70%乙醇，浸泡12 h，回流提取3次，每次2 h，得到70%乙醇提取物;將乙醇提取物用蒸餾水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水溶物。

菌懸液的制備:將供試菌種用適宜的斜面活化后，以無菌水制成含菌數(shù)約為108cfu·mL－1的菌懸液。

抑菌直徑的測(cè)定:采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定。用無菌棉簽蘸取108cfu·mL－1的試驗(yàn)菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂平板表面均勻涂抹3次，然后繞平板邊緣涂抹一周，蓋好平皿，室溫干燥5 min，濾紙片(直徑6.0 mm)平放于無菌平皿內(nèi)160℃干熱滅菌2 h。在濾紙片上分別滴加陽性對(duì)照品鏈霉素(1 g·L－1)、供試樣品乙醇提取物(500 g·L－1)、石油醚部位(100 g·L－1)、乙酸乙酯部位(100 g·L－1)、正丁醇部位(100 g·L－1)、或水溶物(100 g·L－1)溶液 20 μL，開蓋室溫自然晾干，用無菌鑷子將樣片輕輕貼放于平板表面，每個(gè)平板貼3片相同藥液的試驗(yàn)樣片，1片無菌生理鹽水對(duì)照片。各試驗(yàn)菌株在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。測(cè)量抑菌直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

MIC及MBC的測(cè)定:采用微量肉湯稀釋法測(cè)定。MIC為最低抑菌質(zhì)量濃度，即藥物與一定質(zhì)量濃度的菌液作用后能夠抑制可見菌生長的最低質(zhì)量濃度;MBC為最低殺菌質(zhì)量濃度，即在MIC基礎(chǔ)上，從每管吸取10 μL混合液，點(diǎn)于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC培養(yǎng)條件培養(yǎng)，以殺滅99.9%細(xì)菌數(shù)量的最低質(zhì)量濃度。采用二倍稀釋法將供試樣品用無菌生理鹽水稀釋系列濃度，在96孔板上每孔加100 μL不同質(zhì)量濃度的藥液和100 μL菌液，使最終菌液濃度為(1 ～5)×105cfu·mL－1，以無菌生理鹽水加菌液作為對(duì)照，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果分析

從表1 可看出，全部樣品對(duì) Se、Sa、Sc、Ec、Pv、Ca 6種菌種均具有不同程度的抑制作用。其中70%乙醇提取物(500 g·L－1)和乙酸乙酯萃取物(100 g·L－1)的抑菌效果明顯高于其他提取物;而乙酸乙酯萃取物(100 g·L－1)對(duì)6種菌種的抑菌效果明顯高于陽性對(duì)照組鏈霉素，其對(duì)6種菌種的抑制程度由大到小為 Sc、Se、Ca、Sa、Pv、Ec?？梢?，紫椴花對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌均具有顯著的抑制作用，但對(duì)革蘭氏陽性菌及真菌的抑制效果好于革蘭氏陰性菌。

乙酸乙酯萃取物是從70%乙醇提取物中分離出的一個(gè)組份。從表1可見，70%乙醇提取物的抑菌效果稍低于乙酸乙酯萃取物，但明顯高于石油醚萃取物、正丁醇萃取物以及水溶物，表明70%乙醇提取物中抑菌活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯組份中，這為下一步紫椴花抑菌活性成分的研究提供了方向。

表1 紫椴花提取物對(duì)供試菌種的抑菌直徑 mm

2.2 MIC及MBC結(jié)果

對(duì)紫椴花各組分MIC及MBC的測(cè)定結(jié)果見表2。由結(jié)果可看出:石油醚萃取物和水溶物在20 g·L－1范圍內(nèi)無抑菌活性。正丁醇萃取物對(duì)Sa和Ec在20 g·L－1內(nèi)無抑菌活性，而對(duì) Se、Sc、Pv、Ca 有一定的抑菌活性。乙酸乙酯萃取物對(duì)Se、Sa、Sc、Ec、Pv、Ca 6種菌種均具有明顯的抑菌活性，MIC分別為0.625、1.250、0.313、2.500、1.250、0.313 g·L－1，MBC 分別為 1.250 L、2.500、0.313、10.000、2.500、0.625 g·L－1，其對(duì)革蘭氏陽性菌及真菌的作用效果明顯高于革蘭氏陰性菌。而70%乙醇提取物在20 g·L－1質(zhì)量濃度內(nèi)無顯著抑菌活性，但在25～50 g·L－1內(nèi)顯示出抑菌活性，說明70%乙醇提取物中具有抑菌成分，從中分離出的乙酸乙酯萃取物，是其抑菌作用的有效化學(xué)組份。乙酸乙酯組份的MIC及MBC均小于70%乙醇提取物，這也符合中藥有效成分藥效比中藥提取物效果明顯的規(guī)律，進(jìn)一步說明了乙酸乙酯組份為紫椴花抑菌活性的有效部位。

表2 紫椴花各提取物的MIC及MBC g·L－1

3 結(jié)束語

紫椴花70%乙醇提取物對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均具有明顯的抑菌活性，其中乙酸乙酯部位的抑菌效果最好，其對(duì)革蘭氏陽性菌及真菌的抑菌效果好于革蘭氏陰性菌。說明紫椴花具有廣譜殺菌的作用，其作用的有效部位為乙酸乙酯部位。本研究為紫椴花抗菌藥物的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，為紫椴資源的綜合利用提供了方向。

［1］ 周以良.黑龍江樹木志［M］.哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

［2］ 國家中醫(yī)管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

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