戴照義，吳金平，王運(yùn)強(qiáng)，郭鳳領(lǐng)，韋向陽(yáng)

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，武漢，430064）

早春保護(hù)地西瓜上市早，價(jià)格高，經(jīng)濟(jì)效益好，近年來(lái)在湖北發(fā)展較快，其對(duì)西甜瓜嫁接苗的巨大市場(chǎng)需求促進(jìn)了工廠化育苗的快速發(fā)展。但由于部分小型育苗場(chǎng)設(shè)施簡(jiǎn)陋，環(huán)境調(diào)控能力差，加上不注重種子處理，苗期頻發(fā)多種病害。2012年3～4月，湖北省低溫陰雨持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，宜城市小型苗場(chǎng)發(fā)病較重。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所對(duì)其中發(fā)生較為普遍的2種病害進(jìn)行了分離、鑒定，以期對(duì)其防治起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從湖北宜城市流水鎮(zhèn)育苗場(chǎng)西瓜苗上采集病樣，圖1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗铮瑘D1-b病樣的病部呈水漬狀，用組織分離法[1]分離病原菌，然后純化、保存。

1.2 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則[2]進(jìn)行寄主活體接種，接種菌絲，以清水為空白對(duì)照，3次重復(fù)。出現(xiàn)田間相同的癥狀時(shí)再次分離，并將2次獲得的分離菌作比較，以確定該菌病原菌。

圖1 西瓜苗期病害癥狀

1.3 DNA提取

將病原菌菌塊移至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）平板上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)48～72 h，然后將菌落邊緣的菌絲切成2～3 mm的菌落小塊，把4～5塊菌絲移至PSA液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d。將液體培養(yǎng)好的病菌菌絲，在雙層尼龍網(wǎng)上過(guò)濾，用水洗滌2次，以除去菌絲內(nèi)的培養(yǎng)液，收集菌絲，將其包好放在硅膠中過(guò)夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，參照Knapp等[3]報(bào)道的CTAB（Cetyltrim-ethyl ammonium bromide）法提取病菌菌絲DNA。

①PCR引物 病原菌rDNA的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增選用的引物分別為ITS-F和ITS-R，其堿基序列如下[4]：ITS-F（5'-GTCCTAACAAGGTTTCCGTA-3'），ITS-R（5'-TTCTCCGCT TATTGATATGC-3'）。

②PCR混合物 10 mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸 0.6 μL，20 mmol/L 氯化鎂 1.2 μL， 緩沖液 2.0 μL，加 10 μmol/L 引物 ITS-F 和 ITS-R 各 1.0 μL，2 U/μL Taq 酶 1.0 μL，模板 1.0 μL，使用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至 20 μL。

③PCR反應(yīng) 熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循環(huán) 36次；72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)到600 bp左右的條帶，將病原菌基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體進(jìn)行pGEM-T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽(yáng)性克隆送到華大基因測(cè)序公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行分析。根據(jù)序列分析和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，對(duì)所分離的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌回接鑒定

菌絲接種第5天病部有粉紅色霉?fàn)钗铮▓D 2-a）和水漬狀（圖 2-b），與田間癥狀相同。從回接表現(xiàn)癥狀的病葉中再次分離到病原菌。

2.2 病原菌的rDNA-ITS序列驗(yàn)證

用病原菌 rDNA的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約600 bp的特異性片段 （圖3）。測(cè)序后通過(guò)GenBank軟件比對(duì)序列：病樣1-a分離獲得的菌株1～2的rDNA ITS序列與Fusarium oxysporum的相似度達(dá)99%，而西瓜枯萎病的致病菌是尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型（F.oxysporumSchl.f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyber et Hansen），初步判斷所得病菌為西瓜枯萎病致病菌[5]。病樣1-b分離獲得的菌株3～4的rDNA ITS序列與半知菌交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）的序列相似度高達(dá)99%，西瓜葉枯病的致病菌是瓜鏈格孢菌（A.cucumerin），初步判斷所得病菌為西瓜葉枯病致病菌[6]。

3 小結(jié)與討論

西瓜枯萎病和葉枯病均可全生育期發(fā)病，且以中后期發(fā)病為主，傳播途徑以土壤和病殘?bào)w帶菌為主，種子也可攜帶病菌。本研究中苗期大量發(fā)病與嫁接育苗過(guò)程中過(guò)度保濕、連續(xù)陰雨、光照不足、種子消毒不徹底等有關(guān)。

圖2 分離的兩個(gè)菌回接癥狀

本研究所收集的2個(gè)病樣，1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗?，這與已經(jīng)報(bào)道的西瓜枯萎病癥狀相似；1-b病樣的病部初為水漬狀小點(diǎn)，后擴(kuò)展成淺褐色至褐色、圓形或半圓形的水漬狀病斑，這與已報(bào)道的西瓜葉枯病癥狀相似[7]。但為了進(jìn)一步確定病害病原菌，本研究利用位于rDNA上的高度保守序列作為通用引物對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化并測(cè)序，所得序列通過(guò)GenBank上的Blast，確定其分類(lèi)地位。該方法最大優(yōu)點(diǎn)是適用于所有真菌研究，最大缺點(diǎn)是必須通過(guò)測(cè)序才能確定病原菌分類(lèi)地位。而根據(jù)特定生物ITS區(qū)域的DNA序列設(shè)計(jì)出來(lái)的特異引物，因?yàn)椴煌锓N間ITS序列的變異性較大，所以只有與特異性引物相對(duì)應(yīng)的真菌才能擴(kuò)增出相應(yīng)的ITS產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，只需檢查有無(wú)擴(kuò)增條帶即可得出明確的結(jié)果[8]。因此，下一步將設(shè)計(jì)特異引物辨別西瓜不同病害的致病種，使檢測(cè)速度更加快捷，時(shí)間更加縮短，最終使其指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

圖3 西瓜苗期兩病害PCR擴(kuò)增電泳圖

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