李金玉，冉治霖

（1．廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，廣州 510300；2．深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通與環(huán)境學(xué)院，深圳 518172）

H2O2／O3協(xié)同滅活水中隱孢子蟲(chóng)影響因素研究

李金玉1，冉治霖2

（1．廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，廣州 510300；2．深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通與環(huán)境學(xué)院，深圳 518172）

開(kāi)展了H2O2／O3滅活隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）的研究?？疾炝薍2O2和O3投加比例、過(guò)氧化氫作用效果、無(wú)機(jī)金屬離子等因素的影響。結(jié)果表明，H2O2／O3協(xié)同技術(shù)具有最佳的滅活效果，H2O2的投加不僅降低了藥劑（O3）的初始濃度（投量2．0mg／L），而且縮短了滅活時(shí)間（7．0 min），達(dá)到理想的滅活效果（滅活率99．0%以上）時(shí)，H2O2／O3摩爾比為0．8；同時(shí)考察了水中常見(jiàn)離子對(duì)H2O2／O3滅活效果的影響，低濃度的Ca2＋，Mg2＋和Cu2＋等二價(jià)金屬離子均對(duì)滅活起到一定促進(jìn)作用，一價(jià)離子Na＋對(duì)滅活無(wú)明顯的作用，而NO－3，HCO－3和Cl－在一定范圍內(nèi)抑制了H2O2／O3對(duì)隱孢子蟲(chóng)的滅活。

隱孢子蟲(chóng)；H2O2／O3；飲用水；滅活

1 研究背景

隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）是一種感染能力極強(qiáng)的致病性微生物，能夠通過(guò)食物和水進(jìn)入人畜體內(nèi)，引起痙攣、反胃及腹瀉等不良癥狀，是兒童、老人和免疫缺陷者的重要的致病原［1］。免疫力較強(qiáng)的患者，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)闹委熅蜁?huì)痊愈，但對(duì)于免疫力較差者會(huì)導(dǎo)致死亡。據(jù)美國(guó)疾病控制預(yù)防中心估計(jì)，每年約有250萬(wàn)人感染隱孢子蟲(chóng)?。?］。而我國(guó)于1987年在南京首次發(fā)現(xiàn)了人隱孢子蟲(chóng)病病例，之后在江蘇、重慶、安徽、內(nèi)蒙古、福建和湖南均有相關(guān)病例報(bào)道［3］。

目前，已開(kāi)展多種消毒劑滅活隱孢子蟲(chóng)的研究，其中包括：氯氣、氯胺、二氧化氯、臭氧（O3）和紫外線等［4－6］。但隱孢子蟲(chóng)體外有一層卵囊包裹對(duì)傳統(tǒng)的氯消毒法有極強(qiáng)的免疫性，單純投加或使用一種消毒方式無(wú)法達(dá)到理想的滅活隱孢子蟲(chóng)的效果。前期的研究顯示：Cl2投加量大于6．3 mg／L，反應(yīng)時(shí)間360 min，隱孢子蟲(chóng)的滅活率才能達(dá)到99．0%；而ClO2投加量為3 mg／L，反應(yīng)時(shí)間120 min，方可達(dá)到相同的滅活效果；O3能夠快速有效地殺滅隱孢子蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)濃度為105個(gè)／L，O3投量為3 mg／L，作用時(shí)間達(dá)到10 min，能達(dá)到預(yù)期的效果［7－9］。

近年來(lái)，多種消毒方式耦合聯(lián)用技術(shù)被廣泛使用［10－11］，為進(jìn)一步探索提高隱孢子蟲(chóng)滅活效果的可行性，本研究耦合聯(lián)用H2O2和O3技術(shù)，通過(guò)探討單獨(dú)使用H2O2，O3投加比例、過(guò)氧化氫作用效果、溫度、pH值、濁度、有機(jī)物等因素的影響，以求找出H2O2／O3滅活水中隱孢子蟲(chóng)效果的最佳條件，以期為實(shí)際工程中使用H2O2／O3滅活飲用水中隱孢子蟲(chóng)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2．1 實(shí)驗(yàn)材料

隱孢子蟲(chóng)采于患病猴，經(jīng)過(guò)篩、硫酸鋅漂浮和蔗糖梯度離心等步驟，得到濃度為1．0×107個(gè)／mL隱孢子蟲(chóng)樣品，以2．5%重鉻酸鉀懸浮保存于4℃冰箱。

臭氧：將O3通入棕色瓶中，內(nèi)裝有1 L PBS緩沖溶液（pH＝7．0），用靛藍(lán)比色法測(cè)定溶解的臭氧濃度。

過(guò)氧化氫（30%）標(biāo)定方法為：用移液管精確移取待測(cè)溶液至一系列的25 mL具塞比色管中，加入一定量0．05 mol／L草酸鈦鉀溶液并調(diào)節(jié)其pH，搖勻后放置一定時(shí)間，用1 cm比色皿在最大吸收波長(zhǎng)下，以空白待測(cè)溶液（未調(diào)pH值，也未加顯色劑的溶液）為參比，測(cè)定其吸光值。

2．2 試劑及設(shè)備

2．2．1 試 劑

4，6－二脒基－2－苯基－吲哚（DAPI）：Sigma USA；普匹碘胺（PI）：Sigma USA；HBSS平衡鹽溶液：Sigma USA。

2．2．2 儀器設(shè)備

臭氧發(fā)生器為CT－KG2型（廣州益田環(huán)保設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡：OLYPUS BK50；濁度：HACH濁度測(cè)定儀；腐殖酸濃度：島津TOCVPN型測(cè)定儀；pH值：上海精科PHS－3C型pH計(jì)；以Merck NOVE 60多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定NO－，SO2－，HCO－，Ca2＋，Mg2＋和Cu2＋等離子濃度。

2．2．3 方 法

取0．5 mL PBS（磷酸緩沖溶液）保存樣品，加入1 mL HBSS平衡鹽溶液漂洗2次；沉淀于160μL HBSS平衡鹽溶液中，加入20μL DAPI，20μL PI儲(chǔ)備液，37℃溫浴1h。溫浴后加入1 mL HBSS清洗3次，洗去未染上顏色的DAPI和PI。涂片，熒光顯微鏡下鏡檢，各樣品分別取200個(gè)卵孢囊鏡檢。

2．3 實(shí)驗(yàn)方法

分別將H2O2，O2和H2O2／O3通入一棕色瓶，內(nèi)裝有1 L 0．01 mol／L的磷酸鈉緩沖液，調(diào)節(jié)pH值。取若干支10 mL比色管，分別加入稀釋后不同濃度的H2O2和O2緩沖溶液，并迅速投加1×106個(gè)／mL隱孢子蟲(chóng)懸浮液，搖床轉(zhuǎn)速為100 r／min，避光反應(yīng)。檢測(cè)H2O2，O2和H2O2／O3對(duì)隱孢子蟲(chóng)的滅活效果，找出最佳H2O2／O3投加比例和作用時(shí)間，并探討在最佳滅活條件下不同濁度、溫度、pH值、有機(jī)物濃度等對(duì)滅活效果的影響。

3 結(jié)果與討論

3．1 H2O2，O2單獨(dú)投加對(duì)滅活隱孢子蟲(chóng)影響

為驗(yàn)證H2O2／O3產(chǎn)生的羥基自由基對(duì)隱孢子蟲(chóng)的滅活作用，檢測(cè)O3和H2O2單獨(dú)作用對(duì)隱孢子蟲(chóng)滅活率的影響，見(jiàn)圖1?？梢钥吹酵都?．0 mg／L的H2O2后，隱孢子蟲(chóng)的存活率與未投加情況下的幾乎一致，此結(jié)論與Susan等［10］的報(bào)道一致。所選取的H2O2投加濃度5．0 mg／L高于文獻(xiàn)中的報(bào)道濃度。在含有隱孢子蟲(chóng)的溶液中，分別投加0．5，1．0， 2．0和3．0 mg／L的O3后，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，隱孢子蟲(chóng)的滅活率提高，臭氧投量大于3．0 mg／L，作用時(shí)間大于11 min，隱孢子蟲(chóng)的存活率小于0．1%，可以達(dá)到預(yù)期滅活效果（滅活率＞99．9%）。

圖1 O3和H2O2單獨(dú)作用隱孢子蟲(chóng)滅活率變化Fig．1 The effect of O3and H2O2alone on the inactivation of C．parvum

3．2 滅活隱孢子蟲(chóng)最優(yōu)H2O2／O3摩爾比

當(dāng)臭氧的初始濃度為0．5，1．0，2．0和3．0 mg／L，分別配置H2O2／O3的摩爾比為0．1，0．3，0．8和1．2，隱孢子蟲(chóng)濃度為1×106個(gè)／mL，培養(yǎng)箱保持反應(yīng)溫度20℃，pH值為7．0，高嶺土調(diào)節(jié)濁度為1．0 NTU，避光反應(yīng)。利用熒光活性染色法，檢測(cè)不同作用時(shí)間隱孢子蟲(chóng)的滅活率，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)：H2O2／O3協(xié)同作用滅活隱孢子蟲(chóng)的效果明顯好于O3單獨(dú)作用。當(dāng)O3初始濃度為3．0 mg／L時(shí)，作用時(shí)間為11．0 min，隱孢子蟲(chóng)的滅活率可以達(dá)到99．9%。

圖2 不同初始濃度時(shí)H2O2／O3摩爾比對(duì)滅活隱孢子蟲(chóng)的影響Fig．2 The effect ofmolar ratio on the inactivation of C．parvum w ith different initial O3concentrations

當(dāng)體系中加入H2O2，滅活率提高。O3初始濃度為3．0 mg／L，達(dá)到99．9%的滅活率僅需要5．0 min，此時(shí)H2O2／O3的摩爾比為0．8，如果作用時(shí)間僅為5．0 min，隱孢子蟲(chóng)滅活率97．5%。如降低O3初始濃度（0．5，1．0 mg／L），達(dá)到滅活率99．0%時(shí)的作用時(shí)間分別為11．0和9．0 min（圖2（a）和圖2（b）），滅活效果與單獨(dú)使用O3（濃度2．0 mg／L）相當(dāng)。結(jié)果表明：H2O2／O3不僅明顯加快滅活速度，且減少O3投量，顯著提高了滅活效果。因此，O3初始濃度為2．0 mg／L，作用時(shí)間為7．0 min，H2O2／O3摩爾比為0．8時(shí)即可達(dá)到最佳效果。

H2O2／O3聯(lián)用主要是利用臭氧分解產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）來(lái)氧化有機(jī)物，而在臭氧水溶液中加入過(guò)氧化氫，可顯著加快臭氧分解產(chǎn)生羥基自由基。臭氧與水中OH－反應(yīng)生成HO－2·，H2O2會(huì)部分離解也生成為HO－2·，而HO－2·是羥基自由基的誘發(fā)劑，能顯著加快臭氧的自分解生成HO－2·?！H是一種重要的活性氧，從分子式上看是由氫氧根（OH－）失去一個(gè)電子形成。羥基自由基具有極強(qiáng)的氧化能力，氧化電位2．8 V，是自然界中僅次于氟的氧化劑，對(duì)細(xì)菌或病毒細(xì)胞具有強(qiáng)破壞能力。雖然目前的研究并未能完全解釋羥基自由基滅活微生物的機(jī)理，但有2種解釋：①羥基自由基產(chǎn)生的強(qiáng)電位可破壞細(xì)胞壁或形成細(xì)胞膜分化，或者直接與細(xì)胞膜反應(yīng)，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞通透性，從而引起細(xì)胞死亡［11］；②羥基自由基可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)滅活呼吸代謝酶系或者破壞細(xì)胞內(nèi)成分，如核酸等，從而干擾蛋白質(zhì)合成，致使細(xì)胞凋亡［12］。

有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)H2O2加入O3反應(yīng)體系中，可作為重要的誘發(fā)因子，促進(jìn)氧化反應(yīng)。加入H2O2后，一部分O3分解為HO－2，其具有更強(qiáng)的氧化能力，同時(shí)可以加速臭氧降解，可以說(shuō)H2O2促進(jìn)了臭氧的氧化過(guò)程［13］。

3．3 羥基自由基作用

為了確定反應(yīng)體系中羥基自由基的存在及濃度變化，加入叔丁醇（TBA）和HCO－32種自由基抑制劑。其通過(guò)消耗羥基自由基（·OH）的劑量，中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而影響了氧化能力。

圖3為叔丁醇（TBA）和HCO－3與H2O2／O3作用后，對(duì)隱孢子蟲(chóng)滅活率的影響。反應(yīng)條件為H2O2／O3摩爾比0．8，作用時(shí)間5．0 min，濁度為1．0 NTU，溫度22℃。從圖3中可以看出：當(dāng)體系中加入TBA和HCO－32種自由基抑制劑后，隱孢子蟲(chóng)的滅活率迅速下降。當(dāng)分別加入濃度為100 mg／L TBA和HCO－3，隱孢子蟲(chóng)的滅活率分別下降到50．6%和53．8%，抑制劑濃度越大，抑制作用越顯著。

圖3 TBA和HCO－3對(duì)H2O2／O3滅活隱孢子蟲(chóng)的作用Fig．3 Effect of TBA and HCO－3on the inactivation of C．parvum

3．4 水中常見(jiàn)離子的影響

自然水體中含有多種無(wú)機(jī)離子，且濃度比需去除的有機(jī)污染物高得多（幾十至幾百mg／L），水中無(wú)機(jī)離子可能也是影響H2O2／O3作用隱孢子蟲(chóng)滅活率的重要因素。在反應(yīng)體系中分別加入水中常見(jiàn)無(wú)機(jī)離子（Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋，Na＋，HCO－3，Cl－），與未加離子的體系比較，利用熒光染色法檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)存活率。

濁度1．0 NTU，O3濃度3．0 mg／L，pH值為7．0，隱孢子蟲(chóng)濃度為1×106個(gè)／mL，H2O2／O3摩爾比為0．8，溫度20℃，體系中分別加入不同濃度的Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋，Na＋，HCO－3和Cl－，熒光活性染色法檢測(cè)其對(duì)H2O2／O3滅活隱孢子蟲(chóng)的影響，結(jié)果果見(jiàn)圖4（a）至圖4（f）。

圖4（a）中低濃度的Ca2＋（1．0，2．5 mg／L）一定程度上促進(jìn)滅活率的提高，與對(duì)照組比較，此2種濃度的平均滅活率分別提高0．15%和0．19%。但隨著Ca2＋濃度的增加，H2O2／O3作用隱孢子蟲(chóng)滅活率逐漸降低，當(dāng)Ca2＋濃度達(dá)到20．0 mg／L時(shí)，平均滅活率降低4．2%。

Cu2＋的作用效果（圖4（b））與Ca2＋近似，低濃度（0．5，1．0 mg／L）的Cu2＋可以促進(jìn)滅活，當(dāng)濃度逐漸提高至1．5和2．0 mg／L，滅活率低于對(duì)照水平（下降了0．26%）。隨著濃度的進(jìn)一步增加（2．0～10．0 mg／L），出現(xiàn)了與Ca2＋作用效果不同的現(xiàn)象，隱孢子蟲(chóng)的滅活率隨著Cu2＋濃度的增加而提高。其原因可能是Cu2＋與二價(jià)金屬離子Fe2＋相同，可以提高羥基自由基的產(chǎn)生［14］。

Zn2＋濃度0．5～10．0 mg／L并未明顯地促進(jìn)或者抑制隱孢子蟲(chóng)的滅活（見(jiàn)圖4（c））。從圖4（d）中可以看出，Na＋并未明顯地促進(jìn)或者抑制隱孢子蟲(chóng)的滅活率，效果與Zn2＋的作用基本一致。

圖4 不同無(wú)機(jī)離子對(duì)H2O2／O3滅活隱孢子蟲(chóng)的影響Fig．4 Effect of different inorganic ions on the inactivation of C．parvum．

4 結(jié) 論

（1）單獨(dú)投加H2O2對(duì)隱孢子蟲(chóng)并未有很強(qiáng)的滅活效果；單獨(dú)使用O3，其投量需大于3．0 mg／L，作用時(shí)間大于11 min，隱孢子蟲(chóng)的存活率小于0．1%，可以達(dá)到預(yù)期滅活效果（滅活率＞99．9%）。

（2）H2O2／O3聯(lián)用不僅可以明顯加快滅活速度，而且可以減少O3投加量，顯著提高了滅活效果。因此，O3初始濃度為2．0 mg／L，作用時(shí)間為7．0 min，H2O2／O3最佳摩爾比為0．8時(shí)即可達(dá)到最佳滅活效果。

（4）低濃度的Ca2＋（1．0，2．5 mg／L）一定程度上促進(jìn)滅活率的提高，隨著Ca2＋濃度的增加，H2O2／O3滅活作用逐漸降低，當(dāng)Ca2＋濃度達(dá)到20．0 mg／L時(shí)，平均滅活率降低4．2%；Cu2＋的作用效果與Ca2＋近似；Zn2＋濃度0．5～10．0 mg／L并未明顯地促進(jìn)或者抑制隱孢子蟲(chóng)的滅活率；Na＋的效果與Zn2＋的作用基本一致；Cl－抑制了H2O2／O3對(duì)隱孢子蟲(chóng)的滅活，但其強(qiáng)度弱于的作用。究其原因可能是Cl－可以捕獲溶液中的·OH，從而降低了H2O2／O3對(duì)隱孢子蟲(chóng)的滅活率。

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（編輯：趙衛(wèi)兵）

Synergistic Effect of H2O2／O3on the Inactivation of Cryptosporidium parvum in W ater

LI Jin-yu1，RAN Zhi-lin2
（1．Department of Environmental Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2．Department of Transportation and Environment，Shenzhen Institute of Information Technology，Shenzhen 518172，China）

In order to research the synergistic effect of H2O2／O3inactivating Cryptosporidium parvum in water，factors including the proportions of H2O2and O3，the effectof hydrogen peroxide，and the inorganicmetal ion were investigated by using fluorescence stainingmethod．It could achieve the desired inactivation of Cryptosporidium parvum（inactivation rate above 99．0%）．H2O2not only reduces the initial concentration of bactericide（O3dosage of 2．0 mg／L），but also shortens the sterilizing time（7．0 min）．The best H2O2／O3molar ratio is0．8．Common ions in water，such as divalentmetal ions Ca2＋，Mg2＋and Cu2＋play catalytic roles in the inactivation，while Na＋has no obvious effect on the inactivation，and NO－3，HCO－3and Cl－restrain the inactivation of Cryptosporidium parvum to some extent．

Cryptosporidium parvum；H2O2／O3；drinking water；inactivation

X52

A

1001－5485（2013）09－0017－05

10．3969／j．issn．1001－5485．2013．09．004

2013，30（09）：17－21

2013－07－04

廣東省自然科學(xué)基金（S2012040007855）

李金玉（1971－），女，江西吉安人，講師，碩士，主要從事生物化學(xué)及檢測(cè)技術(shù)方面的研究，（電話）13729864056（電子信箱）lijinyu101＠163．com。

冉治霖（1980－），男，河南鄭州人，講師，博士，主要從事水污染控制與資源化方面的研究，（電話）15818686856（電子信箱）ranzl＠sziit．com．cn