譚 剛，王家瑞

1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室(湖北 恩施445000)

2.重慶三峽中心醫(yī)院急救分院外二科(重慶 萬(wàn)州404000)

尾型同源盒基因－2(caudal－related homeobox gene 2，CDX2)屬于同源盒基因家族中的一員，是腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子。MLODZIK最早在果蠅中分離成功CDX2基因及其相關(guān)蛋白，與Parahox家族有高度的同源性［1］。國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證明 CDX2在腸道上皮化生方面表現(xiàn)出具有誘導(dǎo)細(xì)胞向腸上皮分化的作用［2－3］。目前的研究表明結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中CDX2的表達(dá)下調(diào)能引起增殖增加和分化丟失，CDX2基因與其他多基因共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［4］。我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)人直腸癌細(xì)胞XB1847系中未有CDX2表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建攜帶人CDX2基因慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人直腸癌細(xì)胞XB1847系，為在體外進(jìn)一步探討CDX2基因在直腸癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌菌株DH5和包裝細(xì)胞人胚胎腎上皮細(xì)胞293T由本實(shí)驗(yàn)室保存。慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，帶有人全長(zhǎng)CDX2 cDNA質(zhì)粒pOTB7和人直腸癌細(xì)胞XB1847均購(gòu)于上海博耀生物科技有限公司，各種DNA限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶、高保真TaqDNA聚合酶等以及引物合成及測(cè)序由上海生工完成，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 200脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CDX2和GAPDH兔抗人一抗購(gòu)自Santa Cruz公司，紅外熒光染料標(biāo)記的驢抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)LI－COR公司。其余如胎牛血清試劑，空載病毒液試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及 PCR擴(kuò)增 CDX2基因 根據(jù)Gene Bank上人CDX2序列，用primer5軟件設(shè)計(jì)上下游引物(命名為全長(zhǎng)引物)為:CDX2－FW:5'GACCCTCGCCACCATGTAC3'，CDX2－RV:5'CATGGCTCAGCCTGGAATTG3'，擴(kuò)增出981 bp。在上、下游引物的5'端分別加上PmeⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基成為酶切引物，序列如下:5'GGGTTTAAACCCGACCCT CGCCACCATGTACG3'，和 5'GGGTTTAAACCCCATG GCTCAGCCTGGAATTG3'，擴(kuò)增CDX2的編碼序列，共1005bp。以CDX2 cDNA質(zhì)粒pOTB7為模板，使用酶切引物和Tap高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)參數(shù)為 94℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃30s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃ 保存。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(以下凝膠濃度相同)。

1.2.2 重組載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用DNA凝膠試劑盒對(duì)CDX2基因純化回收，PmeⅠ進(jìn)行酶切，再次純化回收;PmeⅠ酶切pWPI載體質(zhì)粒后去磷酸化處理，DNA凝膠試劑盒純化回收。將具有相同酶切平末端的線性pWPI載體和CDX2基因在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得重組載體質(zhì)粒，命名為pWPI－CDX2。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，篩選培養(yǎng)后隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行PmeⅠ酶切和用CDX2基因全長(zhǎng)引物行PCR擴(kuò)增初步鑒定。將PCR鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序。

1.2.3 慢病毒的包裝并感染XB1847細(xì)胞 將測(cè)序正確的pWPI－CDX2擴(kuò)繁并提取質(zhì)粒備用。六孔板中每孔接種約 1.5×106個(gè) 293T細(xì)胞，各加 2 ml DMEM完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2(以下培養(yǎng)條件相同)培養(yǎng)過(guò)夜，取20μl脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000和慢病毒系統(tǒng)三質(zhì)粒pWPI－CDX2載體質(zhì)粒12.7μg+pCMV－dR8.74 包膜質(zhì)粒 2.3 μg+pMD2.G 包裝質(zhì)粒 1.6 μg(實(shí)驗(yàn)組)，按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM 2000說(shuō)明進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染pWPI+pCMV－dR8.74+pMD2.G 進(jìn)另一組293T 細(xì)胞作為空載體(對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染36h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。在轉(zhuǎn)染后36 h～48 h期間收集六孔板中含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃ 5000 g離心10 min，小心吸取上清液分裝后立即放置－80℃保存。將XB1847傳代培養(yǎng)后按每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，冰上解凍病毒液，取600 μl滴入培養(yǎng)XB1847細(xì)胞的24孔板中，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后更換含胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至60h后在熒光顯微鏡下觀察。同樣方法將空載體的病毒液感染另一組XB1847細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.4 慢病毒表達(dá)載體的鑒定

1.2.4.1 PCR 檢測(cè) CDX2基因表達(dá) 將 pWPICDX2慢病毒載體質(zhì)粒感染的XB1847細(xì)胞和對(duì)照組，提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)體系為 20 μl，反應(yīng)參數(shù)為 30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5min，4℃保存，然后以CDX2基因全長(zhǎng)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同前。

1.2.4.2 Western Blot檢測(cè) CDX2 蛋白表達(dá) 將pWPI－CDX2慢病毒載體質(zhì)粒感染的XB1847細(xì)胞和對(duì)照組提取細(xì)胞總蛋白，煮沸變性后行SDSPAGE電泳分離蛋白(5%濃縮膠，12%分離膠)，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，常溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，兔抗人 CDX2多克隆抗體(1∶1000)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1500)4℃過(guò)夜孵育，紅外熒光染料標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶5000)避光作用2h，紅外熒光成像系統(tǒng)掃描。

2 結(jié)果

2.1 CDX2基因片段的獲得 帶有人全長(zhǎng)的CDX2 cDNA質(zhì)粒pOTB7為模板，用酶切引物和Tap高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。約在1000bp處有一條特異條帶，與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度1005bp相符。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增CDX2基因編碼序列電泳圖

2.2 慢病毒表達(dá)載體pWPI－CDX2的構(gòu)建及鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及慢病毒表達(dá)載體pWPI經(jīng)PmeⅠ酶切后進(jìn)行連接，篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)重組質(zhì)粒用全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR和PmeⅠ酶切鑒定，擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度相符的981 bp目的片段，酶切后出現(xiàn)預(yù)期的相應(yīng)片段(11101bp和993bp)，見(jiàn)圖2。并送測(cè)序鑒定。

圖2 重組質(zhì)粒pWPI－CDX2的PCR及PmeⅠ酶切鑒定

2.3 含CDX2重組慢病毒的包裝及感染效果的鑒定 將慢病毒系統(tǒng)三質(zhì)粒 pWPI－CDX2，pCMV－dR8.74，pMD2.G 共同轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后觀察見(jiàn)大量強(qiáng)綠色熒光，證明慢病毒包裝成功。慢病毒毒液感染XB1847細(xì)胞后觀察到顯綠色熒光的XB1847細(xì)胞，發(fā)綠色熒光細(xì)胞平均數(shù)占總細(xì)胞平均數(shù)的90%左右，證明攜帶CDX2基因的慢病毒載體能高效感染XB1847細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

2.4 攜帶CDX2基因慢病毒感染XB1847細(xì)胞后檢測(cè)CDX2表達(dá)結(jié)果

2.4.1 PCR 檢測(cè) pWPI－CDX2 感染 XB1847 細(xì)胞后CDX2基因的表達(dá) 以pWPI－CDX2慢病毒載體質(zhì)粒感染的XB1847細(xì)胞和對(duì)照組的cDNA為模板，分別用CDX2基因全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pWPICDX2感染過(guò)的XB1847細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物可見(jiàn)到預(yù)期的清晰條帶(約981 bp)，對(duì)照組未有條帶出現(xiàn)，證明攜帶CDX2基因慢病毒表達(dá)載體感染XB1847細(xì)胞后CDX2基因能穩(wěn)定表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖4 PCR檢測(cè)CDX2基因的表達(dá)

2.4.2 Western Blot檢測(cè) pWPI－CDX2 感染 XB1847細(xì)胞后CDX2蛋白的表達(dá) 將pWPI－CDX2慢病毒載體質(zhì)粒感染的XB1847細(xì)胞和對(duì)照組分別提取細(xì)胞的總蛋白，經(jīng) Western Blot發(fā)現(xiàn)，pWPI－CDX2感染的XB1847細(xì)胞泳道出現(xiàn)特異的條帶，空載感染的對(duì)照組未有條帶，說(shuō)明攜帶CDX2基因慢病毒表達(dá)載體感染XB1847細(xì)胞后CDX2蛋白能穩(wěn)定表達(dá)。見(jiàn)圖5。

3 討論

圖5 Western Blot檢測(cè)CDX2蛋白的表達(dá)

尾型同源盒基因－2(CDX2)位于染色體13ql2－ql3區(qū)，全長(zhǎng)22－23kb，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，CDX2蛋白由311個(gè)氨基酸組成，其以螺旋－環(huán)－螺旋(helix－loop－h(huán)elix，HLH)的結(jié)構(gòu)與 DNA 的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA的表達(dá)［5］，它是一種轉(zhuǎn)錄因子。CHOI等報(bào)道通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì) 123例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)94例CDX2染色為陽(yáng)性，且陽(yáng)性染色比例跟分化程度密切相關(guān)，Stage A－D 分別為 91.7%、85.1%、69.6%、50% ，并且跟患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，CDX2基因表達(dá)缺失可能在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中起重要作用［6］。許多研究也表明CDX2的表達(dá)在消化道惡性腫瘤中明顯下調(diào)［7］。于秀文等［8］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與正常大腸組織相比較，大腸腺癌患者的組織中CDX2明顯低表達(dá)，CDX2的下調(diào)表達(dá)可能參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，對(duì)臨床判斷預(yù)后具有重要的意義。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中通過(guò)Western Blot檢測(cè)50例直腸癌患者癌組織中的CDX2蛋白表達(dá)量明顯降低，甚至亦有低分化的晚期患者表達(dá)缺失，CDX2蛋白的高表達(dá)可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，直腸癌患者中癌細(xì)胞的浸潤(rùn)擴(kuò)散與其表達(dá)降低相關(guān)，CDX2對(duì)腸上皮細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用，在正常大腸黏膜中CDX2可能扮演了抑癌基因的角色。

慢病毒載體是在HIV－Ⅰ病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，很多研究報(bào)道表明其能高效地將目的基因?qū)雱?dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系中。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)作用穩(wěn)定且持久，目的基因能完整的整合到宿主細(xì)胞基因組中，隨細(xì)胞分裂而復(fù)制，且能高效感染并整合到非分裂細(xì)胞中，與其他傳統(tǒng)病毒載體相比較，避免了如不整合、整合率低、只整合分裂細(xì)胞等局限性。我們使用的慢病毒載體含有氨芐青霉素抗性基因有利于篩選，且在其EMCV IRES的下游，擁有GFP熒光蛋白基因，以此作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記，目前已經(jīng)證明感染細(xì)胞的范圍較寬，可適用于體內(nèi)基因治療，該病毒載體系統(tǒng)不表達(dá)CDX2基因。因此，將其作為人CDX2基因的攜帶者，可以充分發(fā)揮病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，能特異性的使CDX2基因表達(dá)于人直腸癌細(xì)胞XB1847系，為研究目的基因功能提供了很好的工具［9］。

因此我們?cè)O(shè)想通過(guò)將CDX2基因片段克隆入慢病毒表達(dá)載體pWPI，后運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞293T獲得病毒顆粒，再將病毒顆粒感染直腸癌細(xì)胞 XB1847，發(fā)現(xiàn)在XB1847細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CDX2。

本研究結(jié)果達(dá)到預(yù)期設(shè)想，我們所構(gòu)建的攜帶CDX2基因慢病毒表達(dá)載體(pWPI－CDX2)與其輔助質(zhì)粒具有很高的轉(zhuǎn)染效果，通過(guò)熒光顯微鏡直接觀察發(fā)綠色熒光的靶細(xì)胞從而間接知道靶細(xì)胞已成功被轉(zhuǎn)染，大大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。通過(guò)PCR和Western Blot檢測(cè)驗(yàn)證了CDX2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)XB1847細(xì)胞后能穩(wěn)定表達(dá)。CDX2的致癌以及蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，是在體內(nèi)多個(gè)基因的參與下共同完成。我們成功構(gòu)建的攜帶CDX2基因慢病毒表達(dá)載體為今后探討CDX2基因在直腸癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

［1］B ECK F，CH AWENGSAKSOPHAK K，LU CKETT J，et al.A study of regional gut endoderm potency by an alysis of Cdx2 null mut ant chimaeric mice［J］.Dev Biol，2003，255(2):399－406.

［2］應(yīng)健，應(yīng)榮培，應(yīng)崇貴，等.直腸癌組織CDX2蛋白表達(dá)及其臨床意義［J］.腫瘤學(xué)雜志，2013，19(4):281－284.

［3］ZHANG MQ，LIN F，HUI P，et al.Expression of mucins，SI－MA，villin，and CDX2 in small－intestinal adenocarcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2007，128(5):808－816.

［4］MALLO GV，SOU BEYRAN P，LISSITZKY JC，et al.Expression of the Cdx1 an d Cdx2 homeot ic genes leads to reduced malignancy in colon can cer－derived cell［J］.Biol Chem，1998，273(22):14030－14036.

［5］Davies M，Arumugam PJ，Shah VI，et al.The clinical significace of lymph node micrometastasis in stageⅠand stageⅡcolorectal cancer［J］.Clin Transl Oncol，2008，10(3):175－179.

［6］CHOI BJ，KIM CJ，CHO Y G，et al.Al tered expression of CDX2 incolorectal cancers［J］.APMIS，2006，114(1):50－54.

［7］Bai YQ，Yamamoto H，Akiyama，et al.Ectopic expression of homeodomain protein CDX2 in intestinal metaplasia and carcinomas of the stomach［J］.Cancer Lett，2002，176(1):47－55.

［8］于秀文，王顯艷，孫玉榮，等.MUC2、CDX2在大腸腫瘤中聯(lián)合表達(dá)的意義［J］.腫瘤防治研究，2008，35(10):715－719.

［9］Neschadim A，McCart J A，Keating A，et al.A roadmap to safe，efficient，and stable lentivirusmediated gene therapy with hematopoietic cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2007，13:1407－1416.