李力群，陳英偉，王德信，姜海靜，唐志濤

(1.吉林化工學院環(huán)境與生物工程學院，吉林 吉林132022;2.吉林沱牌農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司 技術(shù)部，吉林 吉林132000)

生物資源是地球上最豐富的可再生資源.隨著礦產(chǎn)資源日漸枯竭，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化可再生纖維素物質(zhì)的微生物技術(shù)，煉制生物燃料，具有極其重要的意義和廣闊的發(fā)展前景.我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的各種秸稈，每年約有7億噸.在玉米秸稈等植物纖維水解液中木糖約占25% ～30%，木糖的充分利用是植物纖維資源生產(chǎn)酒精經(jīng)濟可行性的關(guān)鍵之一［1］.將木糖轉(zhuǎn)化為酒精，在理論上可提高酒精產(chǎn)量25%［2］，因此選育優(yōu)良的木糖發(fā)酵酒精菌種勢在必行.

本文從土壤中篩選出了可發(fā)酵木糖為酒精的菌株M-12#，對其進行了初步研究，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

分別采自吉林市九站經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)農(nóng)田和吉林化工學院校園.

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，木糖 20 g/L，蒸餾水1 L，pH 為 5.0，120 ℃滅菌30 min.

YEPD固體培養(yǎng)基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，木糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，蒸餾水1 L，pH為5.0，120℃滅菌30 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基:木糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨 15 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 1 g/L，H2O 1 L，120℃滅菌30 min.

1.1.3 主要儀器、試劑和測定方法

主要儀器和設(shè)備 YP-600型精密電子天平，UV-2000型紫外可見光分光光度計，生化培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-2F型生物超凈工作臺，HYG-A型回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜，SA23031型數(shù)碼生物顯微分析系統(tǒng)等.

主要試劑酵母浸粉，蛋白胨，木糖，瓊脂粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、尿素、硫酸鎂等試劑.

主要測定方法酒精含量測定采用重鉻酸鉀比色法［5］.木糖含量測定采用直接滴定法.生物量的測定采用血球計數(shù)板計數(shù)法和比濁法，在比濁法中，將發(fā)酵液混合均勻后稀釋至一定倍數(shù)，測定其吸光度OD600.

2 實驗方法與實驗結(jié)果

2.1 木糖發(fā)酵酒精菌株的篩選

2.1.1 菌種初篩

取10 g土樣加入到裝有90 mL帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，震蕩30 min，吸取5份10 mL懸濁液分別加入至90 mL YEPD液體培養(yǎng)基中放置搖床培養(yǎng)48 h，搖速140 r/min，溫度30℃.富集后的菌液依次稀釋至10-6、10-7、10-8濃度，每個稀釋度吸取1 mL菌液均勻涂布到Y(jié)EPD固體平板上，30℃培養(yǎng)48 h，對長出的菌落，進行復篩.

2.1.2 菌種復篩

TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)上層培養(yǎng)基:TTC 0.05 g，木糖0.5 g，瓊脂1.5 g，H2O 100 mL.

TTC下層培養(yǎng)基:木糖10.1 g，蛋白胨2 g，酵母膏1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，檸檬酸 0.27 g，瓊脂 20 g，H2O 1 L［3］.

將純化的菌株接入到TTC下層培養(yǎng)基平板，30℃倒置培養(yǎng)兩天，在長出的菌落上倒入TTC上層培養(yǎng)基覆蓋，于30℃下避光保存3 h，根據(jù)不同的菌落顏色等差異進行篩選［4］.

將篩選出來的菌株接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃、120 r/min條件下進行發(fā)酵，48 h后挑出酒精濃度高的搖瓶，將菌液稀釋到相應的濃度，重復TTC法篩選，經(jīng)過不斷的發(fā)酵馴化和篩選，選育出酒精產(chǎn)量高的菌落.

2.2 菌種鑒定

經(jīng)過復篩得到的菌株形態(tài)學特征:菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色均一，乳白色，表面光滑，容易挑起，不透明.液體培養(yǎng)形成菌膜和沉淀，細胞形態(tài)為卵圓柱形，主要以出芽方式繁殖，形成假菌絲，初步鑒定為霉菌，見圖1～2.

圖1 菌株形態(tài)

圖2 菌落形態(tài)

2.3 生長曲線的測定

將菌株接入不同濃度木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，120 r/min條件下培養(yǎng).利用血球計數(shù)板法和濁度法測定霉菌濃度.使用UV-2000型紫外可見光分光光度計，以滅菌的培養(yǎng)基為空白，比色皿厚度為5 mm，測定樣品的OD600值 (注:空白與樣品的稀釋倍數(shù)一致).菌株的生長曲線測定結(jié)果見圖3.

圖3 菌株在不同木糖濃度培養(yǎng)基中的生長曲線

圖3中的曲線表明，木糖濃度變化對霉菌的生長速度有明顯的影響.

2.4 木糖發(fā)酵菌株的馴化

將菌株接種到木糖濃度30 g/L的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min條件下培養(yǎng)96 h.將TTC法篩選出發(fā)酵性能較高的菌株，再次接入木糖質(zhì)量濃度為30 g/L的液體培養(yǎng)基中，同樣條件下連續(xù)培養(yǎng)96 h.經(jīng)過不斷的發(fā)酵馴化和TTC方法篩選過程，不斷提高菌株的木糖發(fā)酵酒精能力和發(fā)酵效率.

2.5 木糖發(fā)酵酒精性能實驗

發(fā)酵培養(yǎng)基木糖濃度分別為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L.250 mL 三角瓶中裝量為100 mL.接種量為2 mL，pH 5.5，28℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24 h測一次酒精度和殘?zhí)橇?測實結(jié)果如圖4～5所示.

圖4 菌株木糖發(fā)酵酒精性能曲線

圖5 菌株木糖發(fā)酵酒精時殘?zhí)橇孔兓€

圖5曲線趨勢表明，當發(fā)酵液中的木糖濃度不高于3%時，殘?zhí)橇枯^少，當木糖濃度高于3%時，殘?zhí)橇颗c木糖濃度成正比.

其中木糖濃度30 g/L實驗產(chǎn)酒精最多，其主要數(shù)據(jù)列于表1.

表1 木糖30 g/L時菌株酒精發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)

表1數(shù)據(jù)表明，當發(fā)酵至120 h時，酒精度達到峰值，為0.147%(v/v)，木糖轉(zhuǎn)化率為0.045 g/g，為理論轉(zhuǎn)化率的9.85%.

2.6 主要影響因素的探索實驗

2.6.1 實驗設(shè)計

分別以木糖濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵液pH值初值為影響因子，設(shè)計三因素三水平的正交實驗，探索影響酒精發(fā)酵的主要因素之間的關(guān)系，因素和水平的設(shè)計見表2.

表2 因素水平設(shè)計表

2.6.2 實驗數(shù)據(jù)

按實驗的設(shè)計要求，每個實驗有五個平行發(fā)酵培養(yǎng)基瓶，115℃下滅菌30 min.然后接入菌種進行發(fā)酵實驗，測定不同時間的殘?zhí)橇亢途凭?，實驗結(jié)果見圖6.

圖6 菌株木糖發(fā)酵酒精正交實驗曲線

2.6.3 正交實驗數(shù)據(jù)處理

采用直觀分析法處理對圖5中的酒精發(fā)酵正交實驗數(shù)據(jù)進行極差分析，得到各因素的極差值:RA=1.908 7，RB=0.284 7，RC=0.078 5.通過比較極差數(shù)值的大小可知，最終影響霉菌木糖發(fā)酵酒精因素的強弱順序為:

A(木糖濃度)＞B(發(fā)酵溫度)＞C(發(fā)酵液pH初值).各因素的R值差異表明:木糖濃度對實驗結(jié)果的影響最大，木糖濃度過高時有將產(chǎn)生嚴重的底物抑制;發(fā)酵溫度的影響次之，而發(fā)酵液pH初值對實驗結(jié)果的影響相對最小.

2.7 選育后的菌株發(fā)酵性能實驗

采用L9(34)正交實驗優(yōu)化菌株的木糖發(fā)酵酒精工藝條件，因素和水平設(shè)計列于表3.

表3 因素和水平設(shè)計表

發(fā)酵溫度:28℃;發(fā)酵時間:66 h;搖床速度:145 r/min;木糖3%，酵母膏0.1%，磷酸二氫鉀0.05%，無水氯化鈣0.025%，實驗結(jié)果列于表4.

表4中實驗4的發(fā)酵酒份最高，達到0.48%(v/v)，殘?zhí)?1.8%，搖瓶裝量:90 mL/250 mL.木糖轉(zhuǎn)化率為 0.316 g/g，達到理論轉(zhuǎn)化率的68.6%.

表4 馴化后菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化正交實驗

3 結(jié) 論

本工作從土壤是篩選得到了一株霉菌M-12#，其主要性能如下:

(1)該霉菌的菌落呈白色，邊緣有缺刻，隆起，表面絲狀向外散射，在顯微鏡下的菌株呈短粗桿狀或棒狀，兩端比較圓滑.

(2)在馴化之前，當木糖濃度為30 g/L，發(fā)酵120 h，發(fā)酵酒精度達到峰值，為0.147%(v/v)，木糖轉(zhuǎn)化率為0.045 g/g，為理論轉(zhuǎn)化率的9.85%.

(3)經(jīng)過二個月地不斷馴化，篩選出來的菌株在木糖濃度為30 g/L的發(fā)酵液中，發(fā)酵66 h，酒精濃度提高了226%，達到0.48%(v/v)，轉(zhuǎn)化率為0.316 g/g，為理論轉(zhuǎn)化率的68.6%.

［1］Rodney JB，NancyN，Brace SD.Fermentations with new recombinant organisms ［J］.Biotechnol.Prog，1999(15):867-875.

［2］曹秀華，阮奇城，林海紅，等.纖維燃料酒精生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進展，中國麻業(yè)科學［J］.2010，32(3):166-169.

［3］祖若夫，胡寶龍，周德慶.微生物學實驗教程［M］.上海:復旦大學出版社，1993.

［4］王梅，張澎湃，帥桂蘭.TTC在黃酒酵母選育中的應用［J］.釀酒，2001(5):62-64.

［5］林仁權(quán)，胡文蘭，陳國亮.重鉻酸鉀氧化分光光度法測定酒中酒精含量［J］.浙江預防醫(yī)學，2006，18(3):78-79.

［6］杜連祥.工業(yè)微生物學試驗技術(shù)［M］.天津:天津科學技術(shù)出版社.1992，10.